Ανοσοπαθολογικές υπογραφές στη μυοκαρδίτιδα
Η μυοκαρδίτιδα και/ή η περικαρδίτιδα είναι σπάνια ανεπιθύμητα καρδιακά συμβάντα που παρατηρούνται μετά τον εμβολιασμό με mRNA του SARS-CoV-2 με προδιάθεση για εφήβους και νεαρούς ενήλικες άνδρες. Για τη διερεύνηση της παθογένεσης της μυοπερικαρδίτιδας σε αυτό το πλαίσιο, οι Barmada και Klein et al.. χρησιμοποίησε αμερόληπτες τεχνικές ανοσολογικού προφίλ για την αναζήτηση ανοσολογικών υπογραφών που ξεχώριζαν τους ασθενείς που ανέπτυξαν μυοπερικαρδίτιδα από υγιείς εμβολιασμένους μάρτυρες. Τα ανοσολογικά συμβάντα που σχετίζονται με τη μυοπερικαρδίτιδα περιελάμβαναν αυξημένα συστηματικά επίπεδα κυτοκινών, αυξημένη συχνότητα ενεργοποιημένων Τ και ΝΚ κυττάρων και επαγωγή φλεγμονωδών μονοκυττάρων με προφιβρωτικά χαρακτηριστικά. Δεν ανιχνεύθηκε ούτε ανοσολογική στόχευση καρδιακών αυτοαντιγόνων ούτε ενισχυμένη κλωνική επέκταση των Β και Τ λεμφοκυττάρων. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν βαθύτερες γνώσεις για την αλυσίδα των γεγονότων που σπάνια μπορούν να οδηγήσουν σε μυοπερικαρδίτιδα στο πλαίσιο του εμβολίου mRNA. —IRW
Αφηρημένη
Σπάνια φλεγμονή του καρδιακού ιστού που προκαλείται από το ανοσοποιητικό μπορεί να συμβεί μετά τον εμβολιασμό, συμπεριλαμβανομένων και μετά από εμβόλια mRNA SARS-CoV-2. Ωστόσο, οι υποκείμενοι ανοσοκυτταρικοί και μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν αυτήν την παθολογία παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Εδώ, ερευνήσαμε μια ομάδα ασθενών που ανέπτυξαν μυοκαρδίτιδα ή/και περικαρδίτιδα με αυξημένα επίπεδα τροπονίνης, νατριουρητικού πεπτιδίου τύπου Β και C-αντιδρώσας πρωτεΐνης, καθώς και ανωμαλίες καρδιακής απεικόνισης λίγο μετά τον εμβολιασμό με mRNA του SARS-CoV-2. Σε αντίθεση με τις πρώιμες υποθέσεις, οι ασθενείς δεν εμφάνισαν χαρακτηριστικά μυοκαρδίτιδας υπερευαισθησίας, ούτε είχαν υπερβολικές αποκρίσεις αντισωμάτων ειδικών για τον SARS-CoV-2 ή εξουδετέρωσης σύμφωνα με έναν υπεράνοσο χυμικό μηχανισμό. Επιπλέον, δεν βρήκαμε στοιχεία για καρδιακά στοχευμένα αυτοαντισώματα. Αντι αυτου, Το αμερόληπτο συστηματικό προφίλ του ανοσοποιητικού ορού αποκάλυψε αυξήσεις στις κυκλοφορούσες ιντερλευκίνες (IL-1β, IL-1RA και IL-15), στις χημειοκίνες (CCL4, CXCL1 και CXCL10) και στις μεταλλοπρωτεάσες μήτρας (MMP1, MMP8, MMP9 και TIMP1). Επακόλουθο βαθύ ανοσοποιητικό προφίλ χρησιμοποιώντας μονοκύτταρο RNA και αλληλουχία ρεπερτορίου μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος κατά τη διάρκεια οξείας νόσου αποκάλυψε επέκταση του ενεργοποιημένου CXCR3+ κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και κύτταρα ΝΚ, και τα δύο φαινοτυπικά μοιάζουν με κύτταρα φονείς που οδηγούνται από κυτοκίνη. Επιπλέον, οι ασθενείς εμφάνισαν υπογραφές φλεγμονώδους και προϊβρωτικού CCR2 + CD163 +μονοκύτταρα, σε συνδυασμό με αυξημένο διαλυτό στον ορό CD163, που μπορεί να συνδέεται με την όψιμη ενίσχυση του γαδολίνιου στην καρδιακή μαγνητική τομογραφία, η οποία μπορεί να επιμείνει για μήνες μετά τον εμβολιασμό. Μαζί, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ανοδική ρύθμιση στις φλεγμονώδεις κυτοκίνες και τα αντίστοιχα λεμφοκύτταρα με ικανότητες καταστροφής του ιστού, υποδηλώνοντας μια παθολογία εξαρτώμενη από κυτοκίνη, η οποία μπορεί περαιτέρω να συνοδεύεται από καρδιακή ίνωση που σχετίζεται με μυελοειδή κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα πιθανότατα αποκλείουν ορισμένους προηγουμένως προτεινόμενους μηχανισμούς μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο mRNA και υποδεικνύουν νέους που σχετίζονται με την ανάπτυξη εμβολίου και την κλινική φροντίδα.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Ο εμβολιασμός κατά του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) είναι μια από τις πιο αποτελεσματικές παρεμβάσεις στη δημόσια υγεία για την καταπολέμηση της συνεχιζόμενης πανδημίας του κορωνοϊού 2019 (COVID-19). Τα εμβόλια SARS-CoV-2 spike mRNA έχουν βρεθεί ότι είναι ασφαλή σε διεθνείς μελέτες που αφορούν εκατοντάδες χιλιάδες άτομα ( 1 – 4 ), αν και στη συνέχεια έχουν αναφερθεί πολύ σπάνιες περιπτώσεις ανεπιθύμητων ενεργειών ( 5 , 6 ). Ένα τέτοιο ανεπιθύμητο συμβάν είναι η φλεγμονή της καρδιάς—δηλαδή, μυοκαρδίτιδα, περικαρδίτιδα ή συνδυασμός των δύο (μυοπερικαρδίτιδα) ( 7 – 12). Η μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο SARS-CoV-2 έχει αναφερθεί ότι εμφανίζεται πιο συχνά σε έφηβους και νεαρούς ενήλικες άνδρες κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας μετά τη δεύτερη δόση ενός εμβολίου mRNA (BNT162b2 ή mRNA-1273) ( 2 , 5 , 13 , 14 ) , αν και μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε δημογραφικές ομάδες μετά από μία ή τρίτη (αναμνηστική) δόση εμβολιασμού mRNA ή μετά από εμβόλια που δεν βασίζονται σε mRNA ( 5 , 15 – 19 ). Έχουν αναφερθεί διάφορες εκτιμήσεις του κινδύνου μυοπερικαρδίτιδας μετά τον εμβολιασμό ( 2 , 7 , 14 , 17 , 20 – 23), με τις πιο πρόσφατες αναφορές να υπολογίζουν συχνότητα από 0 έως 35,9 και 0 έως 10,9 περιπτώσεις ανά 100.000 για άνδρες και γυναίκες, αντίστοιχα, μεταξύ των ηλικιακών ομάδων και των κοορτών εμβολίων mRNA (24 ) . Μια μελέτη της συχνότητας της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο από το δικό μας δίκτυο υγειονομικής περίθαλψης (Νοσοκομείο Yale New Haven) μεταξύ Ιανουαρίου και Μαΐου 2021 εντόπισε οκτώ περιπτώσεις από 24.673 άτομα ηλικίας 16 έως 25 ετών (0,3%) που έλαβαν δύο δόσεις εμβολίου mRNA ( 25 ) .
Δεδομένων των δυσκολιών που σχετίζονται με τη μελέτη τέτοιων σπάνιων περιπτώσεων, η αιτιολογία της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Απαιτείται μηχανιστική κατανόηση της υποκείμενης παθολογίας και των σχετικών ανοσολογικών αλλοιώσεων, καθώς και των πιθανών μακροπρόθεσμων επιπτώσεων και πιθανότατα θα έχει ευρεία σημασία με τις ταχέως αναπτυσσόμενες κλινικές εφαρμογές των αποτελεσματικών τρόπων εμβολίου που βασίζονται σε mRNA ( 26-28 ) . Οι πρώιμες υποθέσεις για την εξήγηση της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο mRNA εικάζουν ότι η πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2, η οποία μπορεί να είναι ανιχνεύσιμη στο αίμα ( 29 ) και αραιά στα καρδιομυοκύτταρα ( 30) ασθενών σε ορισμένες μελέτες, μπορεί να προκαλέσουν καρδιακά στοχευμένα αυτοαντισώματα μέσω μοριακής μίμησης, αν και αυτό δεν έχει μέχρι στιγμής υποστηριχθεί από άλλες αναφορές ( 31 , 32 ). Εναλλακτικές υποθέσεις πρότειναν ότι η μυοκαρδίτιδα υπερευαισθησίας μπορεί αντίθετα να εξηγήσει την παθολογία, βασισμένη κυρίως στην κλινική εικόνα, την ταχεία ανάκαμψη και την αξιοσημείωτη αύξηση της συχνότητας μετά από δεύτερες δόσεις εμβολίων mRNA ( 11 , 33 ). Ωστόσο, οι πρώιμες αναφορές περιστατικών και οι βιοψίες καρδιάς από μικρό αριθμό ασθενών ήταν σε μεγάλο βαθμό ασυνεπείς με μια τέτοια παθολογία ( 9 , 34-36). Οι αναφορές βιοψίας έδειξαν ένα φλεγμονώδες διήθημα που αποτελείται κυρίως από μακροφάγα και Τ λεμφοκύτταρα, αν και διάσπαρτα ηωσινόφιλα, Β κύτταρα και πλασματοκύτταρα σημειώθηκαν επιπλέον σε ορισμένες αναφορές (37 ) . Η αυτοάνοση μυοκαρδίτιδα που προκαλείται από αποκρίσεις T helper τύπου 17 (TH 17 ) είναι ένας άλλος πιθανός μηχανισμός ( 38 , 39 ), αν και δεν βρέθηκαν στοιχεία που να υποστηρίζουν μια τέτοια παθολογία στον περιορισμένο αριθμό ασθενών που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα ( 32 , 40 ). Άλλα επιχειρήματα πρότειναν ανώμαλη ανοσοαντιδραστικότητα, τόσο έμφυτη όσο και προσαρμοστική, που προκαλείται από το mRNA και/ή τα νανοσωματίδια λιπιδίων (LNPs) ( 13 , 41 , 42) .). Περαιτέρω, πρόσφατες μελέτες σε δύο ασθενείς ενέπλεξαν έναν ρόλο για διάφορες φλεγμονώδεις κυτοκίνες καθώς και για φυσικά φονιά (NK) και Τ λεμφοκύτταρα ( 32 , 40 ). Καθένας από αυτούς τους προτεινόμενους μηχανισμούς μπορεί να επηρεαστεί από την ηλικία, το φύλο και το γενετικό υπόβαθρο, οδηγώντας σε αυξημένη επίπτωση σε ορισμένους υποπληθυσμούς ( 13 ). Για να κατανοήσουμε καλύτερα την υποκείμενη παθολογία στη μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο SARS-CoV-2 LNP-mRNA, πραγματοποιήσαμε μια πολυτροπική μελέτη ασθενών με οξεία μυοκαρδίτιδα ή/και περικαρδίτιδα χρησιμοποιώντας αμερόληπτες προσεγγίσεις που ορίζουν τις δυσπροσαρμοστικές ανοσολογικές υπογραφές κατά τη διάρκεια της νόσου.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Κοόρτη ασθενών με μυοπερικαρδίτιδα σχετιζόμενη με εμβόλιο και κλινική εικόνα
Η κλινική μας κοόρτη αποτελείται από 23 ασθενείς με μυοκαρδίτιδα ή/και περικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο. Η κοόρτη ήταν κυρίως άντρες (87%) με μέση ηλικία 16,9 ± 2,2 έτη (που κυμαινόταν από 13 έως 21 έτη), σε συμφωνία με προηγούμενες επιδημιολογικές αναφορές ( 24 ) . Οι ασθενείς είχαν σε μεγάλο βαθμό μη συνεισφέρον παρελθόν ιατρικό ιστορικό και ήταν γενικά υγιείς πριν από τον εμβολιασμό. Οι περισσότεροι ασθενείς είχαν έναρξη των συμπτωμάτων 1 έως 4 ημέρες μετά τη δεύτερη δόση του εμβολίου mRNA BNT162b2 ( Εικ. 1Ακαι πίνακες S1 και S2). Έξι ασθενείς είτε εμφάνισαν για πρώτη φορά συμπτώματα μετά από καθυστέρηση >7 ημερών μετά τον εμβολιασμό (P18, P20, P22 και P23) είτε ήταν τυχαία θετικοί στον SARS-CoV-2 με τεστ αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) κατά την εισαγωγή στο νοσοκομείο (P19 και P21 ) (εικ. S1A); Αυτοί οι έξι ασθενείς αποκλείστηκαν από περαιτέρω αναλύσεις, αν και δυνητικά αντικατοπτρίζουν το εύρος των κλινικών παρουσιάσεων της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο. Η υπόλοιπη κοόρτη των ασθενών μας δεν έδειξε στοιχεία πρόσφατης προηγούμενης λοίμωξης SARS-CoV-2, με αντισώματα στην πρωτεΐνη spike (S) αλλά όχι στην πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου (Ν) και αρνητική ποσοτική PCR ανάστροφης μεταγραφής ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος κατά την εισαγωγή στο νοσοκομείο.
Εικ. 1 . Κλινικές παράμετροι της κοόρτης μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο SARS-CoV-2.
( Α ) Χρονική πορεία για ασθενείς που δείχνει την ημέρα χορήγησης του εμβολίου, την έναρξη των συμπτωμάτων, τη θεραπεία και τη συλλογή δειγμάτων σε σχέση με την εισαγωγή στο νοσοκομείο (ημέρα 0). ( B έως F ) Μέγιστες τιμές επιλεγμένων δεικτών αίματος σε ασθενείς που εξετάστηκαν κατά την εισαγωγή στο νοσοκομείο. Τα κουτιά απεικονίζουν το διατεταρτημόριο (IQR), οι οριζόντιες ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη διάμεσο, τα μουστάκια εκτείνονται σε 1,5 × IQR και οι κόκκινες κουκκίδες δείχνουν την αξία κάθε ασθενούς. Οι διακεκομμένες γραμμές και η γκρίζα περιοχή αντιπροσωπεύουν κανονικά εύρη αναφοράς που χρησιμοποιούνται στο Νοσοκομείο Yale New Haven. CRP, C-αντιδρώσα πρωτεΐνη; BNP, νατριουρητικό πεπτίδιο τύπου Β. WBC, λευκά αιμοσφαίρια; NLR, αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα. REAP, ταχεία δημιουργία προφίλ εξωκυτταρικού αντιγόνου. Κοιλιακοί, αντισώματα; IVIG, ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη. ΜΣΑΦ, μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο.
Η παρουσίαση των συμπτωμάτων ήταν σύμφωνη με την οξεία μυοκαρδίτιδα και/ή περικαρδίτιδα, συμπεριλαμβανομένου του πόνου στο στήθος, των αίσθημα παλμών, του πυρετού, της δύσπνοιας, των πονοκεφάλων, της μυαλγίας, της εφίδρωσης, της κόπωσης, της ναυτίας/έμεσης και/ή της συμφόρησης (πίνακας S1). Ο εργαστηριακός έλεγχος στους περισσότερους ασθενείς κατά την εισαγωγή στο νοσοκομείο έδειξε αυξήσεις στα μέγιστα παρατηρούμενα επίπεδα της τροπονίνης, της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) και του νατριουρητικού πεπτιδίου τύπου Β (BNP) (Εικ. 1, B έως D και πίνακας S1), υποδεικνύοντας οξεία συστηματική φλεγμονή με άμεσο τραυματισμό του μυοκαρδίου. Μερικοί ασθενείς είχαν επίσης λευκοκυττάρωση ( Εικ. 1Ε , για πλήρη διαφορική μέτρηση αίματος, βλέπε εικ. S1, C έως K) και αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα (NLR) ( Εικ. 1F), συμβατή με συστηματική φλεγμονή. Τα επίπεδα των ηωσινόφιλων και των βασεόφιλων ήταν εντός φυσιολογικών ορίων (εικ. S1, F και G).
Το ηλεκτροκαρδιογράφημα (ΗΚΓ) που πραγματοποιήθηκε κατά την εισαγωγή αποκάλυψε μη φυσιολογικά ευρήματα που κυμαίνονται από μη ειδικές ανωμαλίες έως ανυψώσεις του τμήματος ST και καταθλίψεις του τμήματος PR που συνάδουν με περικαρδίτιδα (πίνακας S1). Τα ευρήματα του ηχοκαρδιογραφήματος κατέδειξαν οριακά χαμηλό ή μη φυσιολογικά μειωμένο κλάσμα εξώθησης της αριστερής κοιλίας σε αρκετούς ασθενείς, σύμφωνα με τη διάγνωση μυοκαρδίτιδας και/ή περικαρδίτιδας. Οι περισσότεροι ασθενείς υποβλήθηκαν περαιτέρω σε απεικόνιση καρδιακού μαγνητικού συντονισμού (CMR) κατά τη διάρκεια της οξείας νοσηλείας, αποκαλύπτοντας απεικονιστικές ανωμαλίες συμβατές με οξεία ή υποξεία μυοκαρδίτιδα και/ή περικαρδίτιδα (πίνακας S1 και εικ. S1B).
Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα και μερικοί έλαβαν επίσης στεροειδή και ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη ( Εικ. 1Α και εικ. S1A). Οι ασθενείς έλαβαν εξιτήριο στο σπίτι με βελτιωμένα συμπτώματα και κλινικά εργαστηριακά ευρήματα μετά από 1 έως 6 ημέρες. Αν και οι ασθενείς εμφάνισαν ταχεία υποχώρηση των κλινικών συμπτωμάτων με βελτιωμένα εργαστηριακά ευρήματα, οι περισσότεροι από αυτούς διατήρησαν ορισμένες απεικονιστικές ανωμαλίες. Αυτές περιελάμβαναν όψιμη ενίσχυση γαδολινίου (LGE) σε διαχρονική κλινική παρακολούθηση τουλάχιστον 2 μήνες μετά την έξοδο από το νοσοκομείο, όπως αξιολογήθηκε με CMR (πίνακας S1).
Έλλειψη στοιχείων για δυνητικά παθογόνα αντισώματα στη μυοπερικαρδίτιδα
Για να αξιολογήσουμε πρώτα εάν οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα δημιουργούν υπερπληθωρικές χυμικές αποκρίσεις στον εμβολιασμό, πραγματοποιήσαμε ενζυμικές ανοσοπροσροφητικές δοκιμές (ELISAs) για αντισώματα S, S1 υπομονάδας και υποδοχέα δέσμευσης υποδοχέα (RBD) ειδικά για τον SARS-CoV-2. Σε σύγκριση με υγιείς εμβολιασμένους μάρτυρες (VCs, n = 16), συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι πιο κοντά σε ηλικία σε ασθενείς όπου υπάρχει αυξημένος κίνδυνος για μυοπερικαρδίτιδα σχετιζόμενη με το εμβόλιο [νεότεροι VCs (YVC), n = 6], ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα ( n= 9) δεν είχαν ενδείξεις ενισχυμένων αντισωμάτων κατά του SARS-CoV-2 (εικ. S2, A έως C). Δεδομένων των μάλλον μετρίως μειωμένων επιπέδων των ειδικών για τον SARS-CoV-2 αντισωμάτων που παρατηρήθηκαν στους ασθενείς, στη συνέχεια ερευνήσαμε εάν η ανάπτυξη μυοπερικαρδίτιδας συσχετίστηκε με αμβλύτερη δημιουργία αποκρίσεων εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε αυτούς τους ασθενείς. Πραγματοποιήσαμε δοκιμές εξουδετέρωσης μείωσης της πλάκας (PRNT 50 ) και βρήκαμε μείωση στην εκτιμώμενη ανασταλτική συγκέντρωση ορού 50% (IC 50 ) μεταξύ ασθενών και υγιών VC χωρίς προηγούμενο ιστορικό έκθεσης στον SARS-CoV-2 ( Εικ. 2Α), πιθανώς λόγω των διαφορών στο χρόνο συλλογής δειγμάτων σε σχέση με τον εμβολιασμό (3 έως 11 ημέρες για τους ασθενείς έναντι 7 ημέρες για τους ελέγχους). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα δεν εμφανίζουν ενισχυμένες αποκρίσεις ειδικών για τον SARS-CoV-2 και εξουδετερωτικών αντισωμάτων κατά τη στιγμή της εμφάνισης της οξείας νόσου, αλλά μάλλον εμφανίζουν συγκρίσιμες ή δυνητικά αμβλυμένες αποκρίσεις σε σύγκριση με υγιή VC.
Εικ. 2 . Οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα εμφανίζουν χυμική ανταπόκριση στον εμβολιασμό χωρίς ενδείξεις αντιδραστικών αυτοαντισωμάτων.
( A ) Εκτιμήσεις IC 50 για τίτλους αντισωμάτων εξουδετέρωσης του SARS-CoV-2 κατά του προγονικού SARS-CoV-2 (WA-1) σε ασθενείς ( n = 10) σε σύγκριση με υγιείς VCs ( n = 16), επιπλέον των πιο κοντινών ηλικία σε ασθενείς όπου υπάρχει αυξημένος κίνδυνος για μυοπερικαρδίτιδα σχετιζόμενη με το εμβόλιο (YVCs, n = 6). Οι μαύρες ράβδοι υποδηλώνουν μέσο όρο ομάδας και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν 95% διαστήματα εμπιστοσύνης. Η στατιστική σημασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kruskal-Wallis με διόρθωση Dunn για πολλαπλές συγκρίσεις. ( Β) Heatmap των βαθμολογιών REAP που δείχνει καρδιολογικά αυτοαντισώματα που υπάρχουν σε τουλάχιστον έναν δότη (είτε ασθενείς είτε YVCs), από ένα σύνολο 526 αντιγόνων/επιτόπων που ορίζονται από GO (διαδικασία κυκλοφορικού συστήματος (GO:0003013) ή καρδιακή σύσπαση (GO:0060047 ) ή τον Άτλαντα ανθρώπινης πρωτεΐνης (εμπλουτισμένος/ενισχυμένος ιστός καρδιάς), σε μεμονωμένους ασθενείς ( n = 9) και YVCs ( n = 6). Το αντιγόνο SARS-CoV-2 RBD χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας σε εμβολιασμένα άτομα. Θετική αντιδραστικότητα αυτοαντισώματος ορίζεται ως βαθμολογία REAP ≥ 2, πρωτεϊνική βαθμολογία z ≥ 1,96 και πρωτεϊνική μέση τιμή < 0,5, όπου οι υψηλότερες βαθμολογίες REAP συσχετίζονται με υψηλότερο τίτλο αντισωμάτων και/ή αφθονία όπως επικυρώθηκε προηγουμένως ( 43 , 44). Τα αρνητικά ευρήματα για όλα τα καρδιακά αντιγόνα/επιτόπους που δοκιμάστηκαν από τον Άτλαντα Ανθρώπινων Πρωτεϊνών (81 συνολικά) φαίνονται περαιτέρω στην εικ. S2D.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω εάν οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα παράγουν αυτο-στοχευόμενα αυτοαντισώματα μετά τον εμβολιασμό, χρησιμοποιήσαμε ταχεία εξωκυτταρικό προφίλ αντιγόνου (REAP) για να εξετάσουμε το πλάσμα των ασθενών για αυτοαντισώματα, όπως έχει επικυρωθεί προηγουμένως (43 , 44 ) . Συνολικά, τα αυτοαντισώματα που αναγνωρίζουν 6183 διαφορετικές ανθρώπινες εξωκυτταρικές ή εκκρινόμενες πρωτεΐνες/επιτόπους αξιολογήθηκαν από το REAP. Από αυτά, εστιάσαμε σε 526 αντιγόνα/επιτόπους που σχετίζονται με την καρδιακή λειτουργία, που ορίζονται είτε ως μέλη των όρων της Γονιδιακής Οντολογίας (GO) «διαδικασία του κυκλοφορικού συστήματος» ή «συστολή της καρδιάς» είτε ως «καρδιακός ιστός εμπλουτισμένος/ενισχυμένος» στην ανθρώπινη πρωτεΐνη Ατλας. Η ανάλυσή μας δεν έδειξε αύξηση στη συχνότητα στόχευσης αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα σε σύγκριση με τα YVC ( Εικ. 2Βκαι εικ. S2D). Το REAP που εφαρμόστηκε σε μια ξεχωριστή ομάδα ελέγχου νοσηλευόμενων ασθενών με COVID-19 ( n = 60) έδειξε θετικά σήματα για αρκετά από αυτά τα αυτοαντισώματα που σχετίζονται με την καρδιά, επιδεικνύοντας την ικανότητα ανίχνευσης τέτοιων αυτοαντισωμάτων όταν υπάρχουν (εικ. S2E).
Κυτοκινοπάθεια που αποκαλύφθηκε με αμερόληπτη ανάλυση πρωτεϊνών ορού και υποομάδων ανοσοκυττάρων στη μυοπερικαρδίτιδα
Αφού δεν βρήκαμε στοιχεία που να υποστηρίζουν τη μυοκαρδίτιδα υπερευαισθησίας ή τις διαδικασίες που προκαλούνται από αντισώματα, προσπαθήσαμε στη συνέχεια να υιοθετήσουμε μια ευρεία και αμερόληπτη προσέγγιση για να αποκαλύψουμε ανοσολογικές αλλαγές σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα κατά τη διάρκεια οξείας νόσου. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε αρχικά προφίλ πρωτεΐνης ορού σε ασθενείς ( n = 9) και υγιείς YVCs ( n = 6). Η ανάλυση των κυκλοφορούντων φλεγμονωδών μεσολαβητών στη μυοπερικαρδίτιδα αποκάλυψε αυξήσεις [ρυθμός ψευδούς ανακάλυψης (FDR) < 0,05] των κυτοκινών της οικογένειας της ιντερλευκίνης-1 (IL-1) (IL-1β και IL-1RA) (Εικ. 3Α), σύμφωνα με προηγούμενα κλινικά ευρήματα που υποδηλώνουν οξεία, συστηματική φλεγμονή. Επιπλέον, η κυτοκίνη IL-15, η οποία μπορεί να ενεργοποιήσει ΝΚ και Τ κύτταρα, ήταν αυξημένη στη μυοπερικαρδίτιδα. Παρατηρήθηκαν επίσης αυξήσεις στις κατευθυνόμενες από λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα χημειοκίνες (CCL4, CXCL1 και CXCL10) ( Εικ. 3Α ). Δεδομένου του φλεγμονώδους προφίλ και της καρδιακής βλάβης που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα, διερευνήσαμε επίσης τα επίπεδα μεταλλοπρωτεασών μήτρας και αντίστοιχων αντιρυθμιστικών πρωτεϊνών και διαπιστώσαμε ότι ήταν επίσης αυξημένα [μητρική μεταλλοπρωτεϊνάση 1 (MMP1), MMP8, MMP9 και αναστολέας ιστού της μήτρας μεταλλοπρωτεϊνάση 1 (TIMP1)]. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε διερευνητική ανάλυση βασικών συστατικών (PCA) που περιελάμβανε όλες τις μετρημένες πρωτεΐνες/κυτοκίνες (84 συνολικά από το Σχήμα 3Ακαι εικ. S3) για να προσδιοριστεί εάν υπάρχουν διακριτοί ανοσοποιητικοί φαινότυποι της νόσου μεταξύ των ασθενών και σε σύγκριση με υγιείς YVC. Οι ομάδες διαχωρίστηκαν καλά [κύριο συστατικό 1 (PC1): 47,44% της διακύμανσης], υποδεικνύοντας σαφείς διαφορές στους φαινοτύπους του ανοσοποιητικού και υποδηλώνοντας συνεχιζόμενη κυτταροκινοπάθεια σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα (Εικ. 3Β και εικ. S4, A έως D). Οι ασθενείς φάνηκε επιπλέον να χωρίζονται σε δύο ομάδες (PC2: 21,50% διακύμανσης), όπου η μία χαρακτηριζόταν από MMPs, συμπεριλαμβανομένων των MMP1 και MMP8 ( Εικ. 3Β και εικ. S4, A και B). Κατά την απεικόνιση CMR, οι ασθενείς αυτής της ομάδας (P1, P3, P6 και P9) εμφάνισαν LGE κατά την παρουσίαση, ενώ ο ασθενής στην άλλη ομάδα (P2) δεν είχε LGE (πίνακας S1).
Εικ. 3 . Αύξηση των κυτταροκινών του ανοσοποιητικού στη μυοπερικαρδίτιδα και ταυτοποίηση υποομάδων ανοσοκυττάρων.
( Α ) Διαγράμματα διασποράς επιλεγμένων κυτοκινών σε ασθενείς ( n = 9) και υγιείς YVCs ( n = 6). Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο αμφίπλευρο τεστ κατάταξης Wilcoxon με διόρθωση FDR Benjamini-Hochberg για πολλαπλές συγκρίσεις. Όλες οι πρόσθετες πρωτεΐνες ορού που προσδιορίστηκαν φαίνονται στο Σχ. S3. ( B ) Biplot όλων των πρωτεϊνών ορού που αναλύθηκαν (84 συνολικά) μεταξύ ασθενών και υγιών YVCs (βλ. σχετική PCA στο σχήμα S4, A και B). ( C ) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει την κοόρτη που μελετήθηκε σε επόμενες αναλύσεις scRNA-seq, συμπεριλαμβανομένων παιδιατρικών ανδρών HDs ( n = 4), υγιών E-YVCs ( n = 4), ασθενών με οξεία μυοπερικαρδίτιδα ( n= 4), και ταιριάστηκαν ασθενείς κατά την παρακολούθηση/ανάρρωση ( n = 3). ( Δ ) Οπτικοποίηση UMAP υποσυνόλων ανοσοκυττάρων που προσδιορίζονται από την κοόρτη στο (C), με επιπλέον τέσσερα δείγματα CITE-seq από ασθενείς με MIS-C μετά από SARS-CoV-2 που περιλαμβάνονται για να βελτιώσετε τον σχολιασμό συμπλέγματος χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες επιφάνειας. ενεργώ, ενεργοποιείται? sw, class-switched? u-sw, class-unswitched? mem, μνήμη? NK, φυσικό φονικό κύτταρο. NK T, φυσικό φονικό Τ κύτταρο (CD3 + CD161 + KLRF1 + ); T reg , ρυθμιστικό T; ISG, διεγερμένο από IFN γονίδιο. CTL, κυτταροτοξικό Τ λεμφοκύτταρο; prolif, πολλαπλασιάζοντας? MAIT, σχετιζόμενη με το βλεννογόνο αμετάβλητο T; TEMRA, τερματικά διαφοροποιημένη μνήμη τελεστή CD45RA +Τ; nonclass, nonclassical; int, ενδιάμεσο; τάξη, κλασική? μονο, μονοκύτταρο; cDC, συμβατικό δενδριτικό κύτταρο; pDC, πλασματοκυτταροειδές δενδριτικό κύτταρο. Mig, μεταναστευτικό? HSPC, αιμοποιητικό βλαστικό και προγονικό κύτταρο.
Συμπληρώνοντας την ανάλυση ορού μας, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία μονοκυττάρου RNA (scRNA-seq) σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) των τεσσάρων ασθενών (P1 έως P4) από τους οποίους μπορούσαν να συλλεχθούν κατάλληλα δείγματα κατά τη διάρκεια οξείας ασθένειας για τον καλύτερο προσδιορισμό και συσχέτιση των ανοσοποιητικούς τελεστές στη μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο. Επειδή οι φλεγμονώδεις επιδράσεις από τον εμβολιασμό μπορεί να είναι παροδικές, ενσωματώσαμε αυτά τα δείγματα με δείγματα από υγιείς νεαρούς άντρες δότες που ταιριάζουν για το χρόνο μετά τον εμβολιασμό [πρώιμα νεαρά εμβολιασμένα μάρτυρες (E-YVCs), n = 4 ] . Αυτοί οι έλεγχοι έλαβαν την τρίτη (αναμνηστική) δόση του εμβολίου mRNA, η οποία έχει αναφερθεί ότι προκαλεί μεγαλύτερες φλεγμονώδεις παρενέργειες σε σύγκριση με τη δεύτερη δόση ( 17 , 45) .), ελέγχοντας έτσι την καλοήθη φλεγμονή νωρίς μετά τον εμβολιασμό σε νεαρούς ενήλικες άρρενες για να βοηθήσει στον διαχωρισμό των πιθανών παθολογικών υπογραφών στη μυοπερικαρδίτιδα. Συμπεριλάβαμε επιπλέον δείγματα από τρεις από τους ασθενείς κατά την παρακολούθηση/ανάρρωση (R-P1 191 ημέρες, R-P3 195 ημέρες και R-P4 190 ημέρες μετά τον εμβολιασμό), τέσσερα δείγματα από μάρτυρες παιδιατρικού άνδρα υγιή δότη (HD), και τέσσερα δείγματα από πολυσυστημικό φλεγμονώδες σύνδρομο σε παιδιά (MIS-C) ασθενείς μετά από SARS-CoV-2 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρική ευρετηρίαση μεταγραφωμάτων και επιτόπων με αλληλούχιση [CITE-seq; ( 46 )] για να ενεργοποιήσετε τον εκλεπτυσμένο σχολιασμό υποσυνόλων κυττάρων χρησιμοποιώντας δείκτες επιφανειακής πρωτεΐνης ( Εικ. 3Cκαι πίνακες S2 και S3). Μετά από ποιοτικό έλεγχο και επεξεργασία, λάβαμε συνολικά 221.727 κύτταρα που διαχωρίζονται σε 44 διακριτές κυτταρικές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων μοναδικών υποσυνόλων μυελοειδών, ΝΚ, Β και Τ κυττάρων (Εικ. 3Dκαι εικ. S5, A έως D). Παρατηρήσαμε την παρουσία Β-λεμφοκυττάρων του πλάσματος και διαιρούμενων πλασμαβλαστών σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα (εικ. S6, A και B), η οποία επικυρώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (εικ. S6C). Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω εάν αυτά τα Β-κύτταρα είχαν χαρακτηριστικά αποκρίσεων που αντιδρούν στο αυτοαντιγόνο, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ρεπερτορίου υποδοχέα Β κυττάρων (BCR). Δεν παρατηρήσαμε σημαντική μείωση στην κλωνική ποικιλομορφία ή αύξηση στο ποσοστό των κλώνων ανοσοσφαιρίνης G (IgG) που φιλοξενούν μεταλλαγμένες περιοχές BCR (εικ. S6, D και E), παρέχοντας λίγα στοιχεία για κλωνική επέκταση ή σωματική υπερμετάλλαξη και υποστηρίζοντας ευρήματα από την προηγούμενη εξουδετέρωση μας αναλύσεις αντισωμάτων και REAP. Παρατηρήθηκαν διαφορές στην κατανομή ισοτύπων και στην αναλογία των κυττάρων που εκφράζουν IgG1 ή IgG3 μεταξύ μυοπερικαρδίτιδας και υγιών E-YVCs, αν και αυτά δεν έφτασαν σε στατιστική σημασία (εικ. S6, F έως I). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα δυνητικά υποδηλώνουν μη ειδική επέκταση των Β κυττάρων και των πλασματοβλαστών του πλάσματος λόγω της ευρείας κυτταροκινοπάθειας ή/και δευτερογενών αποκρίσεων στη συστηματική φλεγμονή σε αυτούς τους ασθενείς.
Δυσρύθμιση των ΝΚ κυττάρων στη μυοπερικαρδίτιδα
Δεδομένης της κυτταροκινοπάθειας στη μυοπερικαρδίτιδα και συγκεκριμένα της αύξησης της IL-15 που παρατηρήθηκε στην ανάλυση ορού μας, ερευνήσαμε αρχικά τις αλλαγές στις υποομάδες των ΝΚ κυττάρων. Η αύξηση της IL-15 επικυρώθηκε στην scRNA-seq κοόρτη μας χρησιμοποιώντας ELISA (εικ. S7A). Επιπλέον, παρατηρήσαμε αυξημένες αναλογίες μιας υποομάδας κυττάρων CD16 + NK ( P = 0,087 μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις) σε ασθενείς (εικ. S7B). Αυτή η τάση δεν αντικατοπτρίστηκε σε έμφυτα Τ κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του Vδ2 γδ Τ και των σχετιζόμενων με τον βλεννογόνο αμετάβλητο Τ (MAIT) κυττάρων (εικ. S7, C και D), υποδεικνύοντας πιθανώς μοναδικές επιδράσεις στα κύτταρα ΝΚ. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω εάν αυτό το υποσύνολο NK ρυθμίζει προς τα πάνω γονίδια κατάντη της ενεργοποιητικής κυτοκίνης IL-15, χρησιμοποιήσαμε ένα δημοσιευμένο σύνολο γονιδίων του IL2RBμονοπάτι (GSEA Molecular Signatures Database (MSigDB) M8615) και είδε την ανοδική ρύθμιση διαφόρων γονιδίων (FDR < 0,05), συμπεριλαμβανομένων και των δύο υπομονάδων IL2RG και IL2RB του υποδοχέα IL-15 (εικ. S7E). Για να ορίσουμε καλύτερα τη μεταγραφική υπογραφή σε αυτό το υποσύνολο, χρησιμοποιήσαμε διαφορική έκφραση γονιδίου σε σύγκριση με τα υπόλοιπα κύτταρα CD16 + NK. Τα κορυφαία ρυθμισμένα γονίδια περιελάμβαναν υποδοχείς ΝΚ, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα ενεργοποίησης NKG2D (ή KLRK1 ) που αναγνωρίζει προσδέματα κυτταρικής επιφάνειας που προκαλούνται από στρες, γονίδια που σχετίζονται με την κυτταροτοξικότητα ( GZMA και PRF1 ), δείκτες αποκοκκίωσης και ενεργοποίησης ( LAMP1 , LAMP2 και CD69), καθώς και διάφορες ιντεγκρίνες και χημειοκίνες, μεταξύ άλλων (εικ. S7F). Τα γονίδια που ρυθμίζονται από την κορυφή περιελάμβαναν διάφορες συναγερίνες ( S100A4 , S100A6 , S100A10 και S100A11 ) και γονίδια που διεγείρονται από την ιντερφερόνη (IFN) ( ISG15, ISG20, LY6E, IFITM1, IFITM3 ) , και τα οποία μπορεί να σχετίζονται με το υποσύνολο, απορρύθμιση σηματοδότησης ΝΚ κυττάρων, επειδή αυτό το πρότυπο έκφρασης γονιδίου δεν αντικατοπτρίστηκε σε άλλους τύπους κυττάρων. Ομοίως, σε συμφωνία με τη γνωστή εσωτερίκευση του NKG2D μετά από εμπλοκή συνδέτη, η οποία δρα ως πιθανή αρνητική ανάδραση για την απευαισθητοποίηση των αποκρίσεων των ΝΚ κυττάρων (47 , 48 ), παρατηρήσαμε σημαντικά μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης NKG2D στην επιφάνεια των ΝΚ κυττάρων σε ασθενείς με κυτταρομετρία ροής (εικ. S7G). Μια υπόθεση είναι ότι αυτές οι παράλληλες αναλύσεις μεταγραφών και επιφανειακής πρωτεΐνης για NKG2D αντανακλούν δυνητικά την πρόσφατη κυτταροτοξική εμπλοκή των ΝΚ κυττάρων, σύμφωνα με την ικανότητά τους να μεσολαβούν σε βλάβη ιστού. Συνολικά, περιγράφουμε μια υπογραφή απορρύθμισης και ενεργοποίησης των κυττάρων ΝΚ, η οποία μπορεί να συνδέεται με την ανάπτυξη μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο.
Επέκταση ενεργοποιημένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων στη μυοπερικαρδίτιδα
Στη συνέχεια, για να επιθεωρήσουμε τις αλλαγές στις αναλογίες των υποσυνόλων Τ κυττάρων μεταξύ των ομάδων, λαμβάνοντας υπόψη τις εξαρτήσεις σύνθεσης μεταξύ των υποσυνόλων, χρησιμοποιήσαμε το Μπεϋζιανό μοντέλο scCODA (μυοπερικαρδίτιδα έναντι E-YVCs, FDR < 0,05) ( 49 ) . Παρατηρήσαμε σημαντικά μειωμένες αναλογίες μιας υποομάδας CD4 + προγενέστερων Τ κυττάρων σε συνδυασμό με ισχυρές επεκτάσεις κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL), τόσο CD4 + όσο και CD8 + , και πολλαπλασιαζόμενα Τ κύτταρα στη μυοπερικαρδίτιδα ( Εικ. 4, Α έως Δ ). Κατά την εξέταση της μεταγραφικής υπογραφής αυτών των διευρυμένων υποσυνόλων, σημειώσαμε τη μοναδική έκφραση διαφόρων δεικτών ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων της προγραμματισμένης πρωτεΐνης κυτταρικού θανάτου (PD-1) (PDCD1) και CD38/HLA-DR ( Εικ. 4Ε), το οποίο επικυρώθηκε περαιτέρω με κυτταρομετρία ροής σε CD8 + Τ κύτταρα ( Εικ. 4F ). Αυτά τα CTL και τα πολλαπλασιαζόμενα Τ κύτταρα εξέφρασαν περαιτέρω τους υποδοχείς χημειοκίνης CXCR3 και CCR5 ( Εικ. 4Ε ), των οποίων οι συνδέτες – CXCL10 και CCL4, αντίστοιχα – αποδείχθηκε ότι ήταν σημαντικά αυξημένοι στην προηγούμενη ανάλυση ορού της κοόρτης ασθενών ( Εικ. 3Α ). Αυτές οι χημειοκίνες είναι γνωστό ότι παίζουν κεντρικούς ρόλους στη στρατολόγηση των Τ κυττάρων στον καρδιακό ιστό, οδηγώντας σε καρδιακή διήθηση προφλεγμονωδών CTL, και έχουν περιγραφεί προηγουμένως στο πλαίσιο διαφόρων φλεγμονωδών καρδιαγγειακών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένης της κλασικής μυοκαρδίτιδας (50-58 ) . Επιπλέον, αυτά τα υποσύνολα κυττάρων εκφράζουν περφορίνη ( PRF1) και ένα ποικίλο σύνολο γρανζύμων (συμπεριλαμβανομένων των GZMA , GZMB , GZMH και GZMK ), που τα εξοπλίζουν ώστε να προκαλούν βλάβη στους ιστούς ( Εικ. 4Ε ). Περαιτέρω, τα CD8 + Τ κύτταρα σε ασθενείς εμφάνισαν σημαντικά αυξημένους φωσφορυλιωμένους μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές της μεταγραφής 3 (STAT3) (pSTAT3), υποδεικνύοντας συνεχή ανίχνευση κυτοκίνης, σε σύγκριση με τα E-YVCs με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 4G ) . Αντίθετα, δημοσιευμένες μελέτες υγιών εμβολιασμένων δοτών έδειξαν μέγιστη αύξηση στο pSTAT3 1 ημέρα μετά τον δευτερογενή εμβολιασμό με mRNA ( 59). Για να ελέγξουμε την υπόθεση ότι αυτά τα κύτταρα είναι παρόμοια με τα CTL της καρδιάς, εκπαιδεύσαμε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας δημοσιευμένα δεδομένα μονοκυττάρου καρδιακών Τ κυττάρων ( 60 ) για να προβλέψουμε σύμφωνες υποομάδες κυττάρων στο σύνολο δεδομένων μας με βάση τη γονιδιακή έκφραση. Αν και πολλαπλά υποσύνολα κυττάρων χαρτογραφήθηκαν σε κύτταρα T καρδιάς CD4 + τελεστής μνήμης (CD4 + T_tem) (υποδηλώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα είναι πιο μεταγραφικά παρόμοια με τα κύτταρα Τ που κυκλοφορούν στο αίμα) και άλλα δεν χαρτογραφήθηκαν καλά σε κανένα μεμονωμένο καρδιακό πληθυσμό (πιθανόν λόγω ιστού προσαρμοστικότητα ή ειδικές για νόσο υπογραφές), CD8 + CTL χαρτογραφημένα με υψηλή συχνότητα στο αντίστοιχο καρδιακό υποσύνολο ( Εικ. 4Η ), υποδηλώνοντας πιθανώς ομοιότητες πέρα από το προφίλ κυτταροτοξικότητας.
Εικ. 4 . Επέκταση ενεργοποιημένων CTL στη μυοπερικαρδίτιδα.
( Α έως Δ ) Διαγράμματα πλαισίου που δείχνουν τις μέσες αναλογίες τεσσάρων υποσυνόλων Τ κυττάρων (CD4 + προγενέστερα TI, CD4 + και CD8 + CTL, καθώς και πολλαπλασιαζόμενα Τ κύτταρα) μεταξύ των ομάδων. Τα πλαίσια υποδηλώνουν το IQR, οι οριζόντιες ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη διάμεσο, τα μουστάκια εκτείνονται σε 1,5 × IQR και οι κουκκίδες δείχνουν τις τιμές κάθε δότη. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Μπεϋζιανό μοντέλο scCODA ( 49 ) λαμβάνοντας υπόψη τις εξαρτήσεις σύνθεσης μεταξύ κυτταρικών υποσυνόλων στα δεδομένα scRNA-seq ενώ ελέγχεται για ψευδείς ανακαλύψεις (FDR < 0,05 στη μυοπερικαρδίτιδα έναντι των E-YVCs). ( E ) Διάγραμμα σημείων που δείχνει την έκφραση των δεικτών ενεργοποίησης (PD-1 και CD38/HLA-DR), των υποδοχέων χημειοκίνης (CXCR3 και CCR5 ), και γονίδια κυτταροτοξικότητας (περφορίνη και γρανζύμα) που χαρακτηρίζουν τις υποομάδες Τ κυττάρων που φαίνονται στα (Β έως Δ). ( F ) Κυτταρομετρία ροής που ποσοτικοποιεί το ποσοστό του πληθυσμού CD38 + HLA-DR + από CD8 + Τ κύτταρα σε όλες τις ομάδες (αριστερά), με αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις για E-YVC και δότες ασθενών (P2) (δεξιά). Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο τεστ δύο ουρών μεταξύ των ομάδων E-YVC και μυοπερικαρδίτιδας και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το SE. ( G ) Ποσοστό pSTAT3 σε CD8 + Τ κύτταρα σε όλες τις ομάδες με κυτταρομετρία ροής. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε όπως στο (F) και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SE. (Η ) Χάρτης θερμότητας που απεικονίζει το ποσοστό κάθε υποομάδας Τ-λεμφοκυττάρων που προσδιορίστηκε σε αυτή τη μελέτη και χαρτογράφησε, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης που βασίζεται σε γονιδιακή έκφραση με μέση πιθανότητα πρόβλεψης 0,9, σε κάθε υποσύνολο από δημοσιευμένα δεδομένα μονοκυττάρων πληθυσμών καρδιακών Τ κυττάρων ( 60 ).
Επιπλέον, για να αξιολογηθεί η πιθανότητα κλωνικής επέκτασης σε αυτά τα απορρυθμισμένα υποσύνολα Τ κυττάρων, αναλύσαμε το ρεπερτόριο των υποδοχέων Τ κυττάρων (TCR) ασθενών με μυοπερικαρδίτιδα. Μια αξιολόγηση της ποικιλομορφίας του ρεπερτορίου, όπως μετρήθηκε με βάση τον πλούτο και την ομαλότητα (δείκτης/πλούτος Shannon), αποκάλυψε ότι τα μη πρωτογενή CD4 + και CD8 + Τ κύτταρα ήταν πολύ διαφορετικά μεταξύ των ομάδων (εικ. S8A). Παρόλο που τα CTL και τα πολλαπλασιαζόμενα Τ κύτταρα επεκτάθηκαν σε ασθενείς ( Εικ. 4, B έως D ), δεν είδαμε σημαντικές αλλαγές στη χρήση του Vβ και βρήκαμε λίγα στοιχεία για εξαιρετικά διευρυμένους κλώνους σε αυτά τα κύτταρα (εικ. S8, B και C) , αν και η πιθανότητα αυτοαντιδραστικών κυττάρων δεν μπορεί να αποκλειστεί πλήρως. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα δεν εμφάνισαν επέκταση του TRBV11-2+ παθογόνα Τ κύτταρα όπως φαίνεται στο MIS-C που σχετίζεται με τον SARS-CoV-2 (εικ. S8D) ( 61 – 64 ). Συνοπτικά, τα Τ κύτταρα στη μυοπερικαρδίτιδα φέρουν ενεργοποιημένη υπογραφή παρά το γεγονός ότι έχουν συγκρίσιμη ποικιλομορφία με υγιή VCs, σύμφωνα με μια εξαρτώμενη από κυτοκίνη ενεργοποίηση των CTL μετά τον εμβολιασμό.
Δυσρρύθμιση μονοκυττάρων με ένδειξη καρδιακής ίνωσης στη μυοπερικαρδίτιδα
Με το εκτεταμένο προφίλ φλεγμονής που παρατηρείται στη μυοπερικαρδίτιδα και τα σημεία καρδιακής βλάβης και LGE στην απεικόνιση CMR, διερευνήσαμε τελευταία τις αλλαγές στο έμφυτο μυελοειδές διαμέρισμα. Η ανάλυση σύνθεσης (scCODA, FDR < 0,05) αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στα CD14 αμυδρά CD16 + μη κλασικά μονοκύτταρα, τα οποία είναι συνήθως αντιφλεγμονώδη ( 65 , 66 ), σε συνδυασμό με μια αύξηση στα φλεγμονώδη CD14 + CD16 – κλασικά μονοκύτταρα ( Εικ. 5, Α και Β ). Αυτά τα κλασικά μονοκύτταρα έδειξαν περαιτέρω αυξημένη έκφραση γονιδίων από την οικογένεια αλαρμινών S100A στη μυοπερικαρδίτιδα ( Εικ. 5C), υποστηρίζοντας τον ρόλο τους στη φλεγμονώδη απόκριση και συνάδουν με τις αυξήσεις που είδαμε στην IL-1β ( 39 , 67 , 68 ). Τέτοια κλασικά μονοκύτταρα μπορούν περαιτέρω να διαφοροποιηθούν σε μακροφάγα ιστού και να συμβάλουν σε χρόνια νόσο ( 65 ). Για να προσδιορίσουμε καλύτερα αυτή την πιθανότητα στη μυοπερικαρδίτιδα, χρησιμοποιήσαμε ένα δημοσιευμένο σύνολο δεδομένων 238 γονιδίων (GSEA MSigDB M3468) που κωδικοποιούν ένζυμα/πρωτεΐνες και ρυθμιστές που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της εξωκυτταρικής μήτρας. Παρατηρήσαμε μια προς τα πάνω ρύθμιση αυτής της αναδιαμόρφωσης και της πλεονεκτικής υπογραφής σε κλασικά μονοκύτταρα ασθενών με μυοπερικαρδίτιδα ( Εικ. 5D ), σύμφωνα με την προηγούμενη ανάλυση πρωτεΐνης/ενζύμου ορού σε αυτούς τους ασθενείς ( Εικ. 3Α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης (FDR < 0,05, logFC >0,1), αποκαλύπτοντας την προς τα πάνω ρύθμιση διαφόρων ειδικών γονιδίων που μοιράζονται μεταξύ των ασθενών ( Εικ. 5Ε ). Αυτά τα γονίδια περιελάμβαναν το CD163 , το οποίο σηματοδοτεί τα μακροφάγα που κατοικούν στον ιστό ( 69 ) και έχει συσχετιστεί με έναν προφιβρωτικό φαινότυπο ( 70 ). Θετική ανοσοχρώση CD163 αναφέρθηκε προηγουμένως σε φλεγμονώδεις διηθήσεις του μυοκαρδίου στη μυοκαρδίτιδα μετά από εμβολιασμό κατά COVID-19 ( 71 , 72 ) και αδενοϊού (Ad26.COV2.S) SARS-CoV-2 ( 73 ). Αυτά τα μονοκύτταρα εξέφρασαν επίσης CCR2 ( Εικ. 5Ε), το οποίο επιτρέπει τη μετανάστευση σε σημεία τραυματισμού ιστού και τη διαφοροποίηση σε φλεγμονώδη καρδιακά μακροφάγα, συμπεριλαμβανομένης της μυοκαρδίτιδας ( 66 , 74-76 ). Η αφθονία των μακροφάγων CCR2 + έχει συσχετιστεί με καρδιακή αναδιαμόρφωση και ίνωση ( 74 , 77 ). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με τις αυξήσεις σε διάφορα ΜΜΡ που φαίνονται από την προηγούμενη ανάλυση ορού της κοόρτης ασθενών ( Εικ. 3Α ). Άλλα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται στην επεξεργασία προκολλαγόνου ( ADAMTS2 ), την προσκόλληση και τη μετανάστευση ( ITGAM , επίσης γνωστή ως MAC-1 ή CD11b), καθώς και πιθανή φλεγμονή και οξειδωτικό στρες ( CLEC4E, RNASE2 , FKBP5 , GSR , MARC1 και SULT1A1 ) ( Εικ. 5Ε ). Κατά την ενεργοποίηση μονοκυττάρου/μακροφάγου, το CD163 αποβάλλεται από την κυτταρική επιφάνεια και τα επίπεδά του στον ορό μπορούν περαιτέρω να συσχετιστούν με ίνωση ( 78 , 79 ). Στους ασθενείς μας, το διαλυτό CD163 (sCD163) επιβεβαιώθηκε ότι είναι σημαντικά αυξημένο στον ορό ( Εικ. 5F ). Μαζί, τα ευρήματά μας παρέχουν δυνητικά μια μηχανιστική σύνδεση με τα ευρήματα LGE στην πλειονότητα των ασθενών στην κοόρτη μας ( Εικ. 5G ), η οποία μπορεί να επιμείνει για μήνες μετά τον εμβολιασμό ( Εικ. 5Η). Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί περαιτέρω να υποδηλώνουν την ανάγκη για προσεκτική μακροχρόνια παρακολούθηση ασθενών με μυοκαρδίτιδα και/ή περικαρδίτιδα που παρουσιάζουν σημεία καρδιακής ίνωσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν τους τελεστικούς ανοσοποιητικούς πληθυσμούς στη μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο, σύμφωνα με δημοσιευμένες αναφορές βιοψίας που καταδεικνύουν κυρίαρχο μακροφάγο και λεμφοκυτταρικό ανοσοδιήθημα του προσβεβλημένου καρδιακού ιστού (30 , 34-37 , 80 ) .
Εικ. 5 . Φλεγμονώδεις και πλεονεκτικές υπογραφές μονοκυττάρων στη μυοπερικαρδίτιδα.
( Α και Β ) Πλαίσιο διαγράμματα που δείχνουν τις μέσες αναλογίες των μη κλασικών (CD14 αμυδρό CD16 + ) και των κλασικών (CD14 + CD16 − ) υποσυνόλων μονοκυττάρων μεταξύ των ομάδων. Τα πλαίσια υποδηλώνουν το IQR, οι οριζόντιες ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη διάμεσο, τα μουστάκια εκτείνονται σε 1,5 × IQR και οι κουκκίδες δείχνουν τις τιμές κάθε δότη. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Μπεϋζιανό μοντέλο scCODA ( 49 ) λαμβάνοντας υπόψη τις εξαρτήσεις σύνθεσης μεταξύ κυτταρικών υποσυνόλων στα δεδομένα scRNA-seq ενώ ελέγχεται για ψευδείς ανακαλύψεις (FDR < 0,05 στη μυοπερικαρδίτιδα έναντι των E-YVCs). ( Γ και Δ) Μέση βαθμολογία έκφρασης (C) φλεγμονωδών γονιδίων από την οικογένεια αλαρμινών S100A ( S100A8-12 , FDR < 0,05, logFC > 0,1 στη μυοπερικαρδίτιδα έναντι των E-YVCs) και (D) 238 γονίδια από ένα δημοσιευμένο σύνολο δεδομένων εξωκυτταρικής μήτρας (ECM ) αναδιαμόρφωση (GSEA MSigDB M3468) στο ίδιο κλασικό υποσύνολο μονοκυττάρων που φαίνεται στο (Β) μεταξύ των ομάδων. Η στατιστική σημασία μεταξύ των βαθμολογιών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο αμφίπλευρο τεστ κατάταξης Wilcoxon συγκρίνοντας τις ομάδες E-YVC και μυοπερικαρδίτιδας. ( E ) Διάγραμμα κουκκίδων που δείχνει κορυφαία διαφορικά εκφρασμένα και ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια στο ίδιο κλασικό υποσύνολο μονοκυττάρων που φαίνεται στο (Β) μεταξύ των δοτών (FDR < 0,05, logFC > 0,1 στη μυοπερικαρδίτιδα έναντι των E-YVCs). ( Φ) Μέτρηση ELISA του sCD163 στον ορό μεταξύ των ομάδων. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο τεστ δύο ουρών μεταξύ των ομάδων E-YVC και μυοπερικαρδίτιδας και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το SE. ( Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες CMR οξείας μυοπερικαρδίτιδας και παρακολούθησης/ανάρρωσης (191 ημέρες για το P1 και 82 ημέρες για το P3 μετά τον εμβολιασμό) που δείχνουν επίμονο LGE (κίτρινα βέλη) που παρατηρήθηκαν σε ένα υποσύνολο ασθενών (από 17 ασθενείς που περιλαμβάνονται στην κοόρτη μας, κατά την εισαγωγή , 11 ήταν LGE θετικά, 4 ήταν LGE αρνητικά και 2 δεν είχαν CMR). Ειδικότερα, για την P1, ανάκτηση αναστροφής ακολουθίας φάσης τεσσάρων θαλάμων (PSIR) που δείχνει έμπλαστρο υποεπικαρδιακό LGE κατά μήκος του πλευρικού τοιχώματος της αριστερής κοιλίας από τη βάση μέχρι την κορυφή (οξεία), με βελτίωση τόσο σε ποσότητα όσο και σε ένταση κατά την παρακολούθηση (ανάκτηση). Για το P3, PSIR βραχέος άξονας μέσης κοιλίας που δείχνει υποεπικαρδιακή έως σχεδόν διατοιχωματική LGE που προστατεύει την υποενδοκαρδιακή περιοχή (οξεία), η οποία βελτιώθηκε ήπια σε ένταση και ποσότητα κατά την παρακολούθηση (ανακτήθηκε). ( Η) Στοιβαγμένες ραβδώσεις που απεικονίζουν το ποσοστό των ασθενών που κατηγοριοποιήθηκαν με CMR Αλλαγές LGE σε δύο παρακολούθηση μετά τον εμβολιασμό/πρώτη εισαγωγή [διάμεσες ημέρες (IQR)]. Πρόσθετες λεπτομέρειες των απεικονιστικών ευρημάτων και των ασθενών με LGE κατά την εισαγωγή και την παρακολούθηση παρέχονται στον πίνακα S1.
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Αν και σπάνια, η μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο έχει αναδειχθεί ως σημαντικός τομέας έρευνας με επιπτώσεις για επιστήμονες και γιατρούς που εργάζονται για τη βελτιστοποίηση των στρατηγικών εμβολιασμού ( 81 , 82) .). Η κατανόηση του πώς και εάν αυτές οι σπάνιες ανεπιθύμητες ενέργειες προκύπτουν από δυσπροσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις που προκαλούνται από αντιγόνα με εμβόλια ή εάν προκύπτουν αντ’ αυτού από ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από στοιχεία της πλατφόρμας χορήγησης εμβολίου LNP-mRNA είναι ένα ζήτημα καίριας σημασίας δεδομένου του τεράστιου κλινικού δυναμικού για αυτήν την αποτελεσματική μέθοδο εμβολίου. Επιπλέον, η γνώση σχετικά με τα διαχρονικά κλινικά αποτελέσματα της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο SARS-CoV-2 mRNA είναι επί του παρόντος αραιή. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε πολυτροπικές αναλύσεις σε μια ομάδα ασθενών που ανέπτυξαν μυοκαρδίτιδα ή/και περικαρδίτιδα μετά τη λήψη εμβολίου mRNA κατά του SARS-CoV-2, που περιλαμβάνει την πρώτη ανάλυση σε επίπεδο συστήματος του ανοσοποιητικού τοπίου σε τέτοιους ασθενείς.
Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές ( 5 , 7 , 9 , 10 , 12 , 13 ), η πλειονότητα των ασθενών στην κοόρτη μας ήταν έφηβοι ή νεαροί ενήλικες άνδρες που εμφανίστηκαν λίγες ημέρες μετά τη δεύτερη δόση ενός εμβολίου mRNA και χαρακτηρίστηκαν από οξεία συστηματική φλεγμονή , αυξημένα επίπεδα τροπονίνης και BNP και καρδιακές ανωμαλίες απεικόνισης. Πρώτον, δείχνουμε ότι αυτοί οι ασθενείς δεν εμφάνισαν ηωσινοφιλία ή αυξημένες κυτοκίνες TH2 , σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις ( 7 , 9 ), κάνοντας εναλλακτικές υποθέσεις υπερευαισθησίας ή ηωσινοφιλικής μυοκαρδίτιδας ( 11 , 33 ).) απίθανες εξηγήσεις της υποκείμενης παθογένειας. Επιπλέον, οι αναλύσεις μας για τη χυμική απόκριση στον εμβολιασμό αποκάλυψαν ότι οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα παρήγαγαν τυπικά ή ακόμη χαμηλότερα ειδικά αντισώματα για τον SARS-CoV-2 και εξουδετερώνοντας αποκρίσεις αντισωμάτων σε σχέση με υγιή VCs, σύμφωνα με προηγούμενα αποτελέσματα (40 ) . Αυτοί οι ασθενείς επίσης δεν εμφάνισαν στοιχεία για καρδιακά στοχευμένα αυτοαντισώματα, τα οποία έχουν αναφερθεί σε λοίμωξη από SARS-CoV-2 ( 83 – 85 ), σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις που αναφέρθηκαν από έναν ασθενή ( 32 ). Αν και αντισώματα anti–IL-1RA έχουν αναφερθεί σε ορισμένους ασθενείς από άλλη αναφορά ( 80), η ανάλυση μη καρδιακών αντιγόνων σε μια υποομάδα ασθενών από την κοόρτη μας δεν έδειξε τέτοια αυτοαντισώματα ( 86 ). Με συνέπεια, η ανάλυση του ρεπερτορίου BCR μας έδειξε λίγα στοιχεία για κλωνική επέκταση Β κυττάρων ή σωματική υπερμετάλλαξη σε ασθενείς. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι ούτε οι υπερπληθωρικές ούτε οι διασταυρούμενες χυμικές αποκρίσεις είναι πιθανές εξηγήσεις της παθογένεσης ( 13 , 87 ).
Αντίθετα, χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη και βασισμένη στο σύστημα προσέγγιση, αποκαλύπτουμε ότι οι ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο χαρακτηρίζονται από συστηματική κυτταροκινοπάθεια και ενεργοποιημένα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα με διακριτές μεταγραφικές υπογραφές που συνάδουν με τη δυνατότητά τους να προκαλούν βλάβη στον καρδιακό ιστό. Πρώτον, παρατηρήσαμε μια υπογραφή ενεργοποίησης σε κύτταρα ΝΚ με απορύθμιση του ενεργοποιητικού υποδοχέα NKG2D, πιθανώς συνδεδεμένη με μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο. Ο NKG2D είναι ένας ενεργοποιητικός υποδοχέας που δεσμεύει προσδέματα στρες στους ιστούς, συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς ( 88 ), προκαλώντας κυτταροτοξικές αποκρίσεις τελεστών ( 89 – 96 ). Αύξηση και ενεργοποίηση κυττάρων ΝΚ αναφέρθηκε επίσης σε δύο ασθενείς με μυοκαρδίτιδα/μυοπερικαρδίτιδα σχετιζόμενη με το εμβόλιο από διαφορετικές μελέτες ( 32, 40 ). Αυτές οι κυτταρικές αλλαγές συνδυάστηκαν με αυξημένη IL-15 ορού, έναν ισχυρό ενεργοποιητή των ΝΚ και Τ κυττάρων, μεταξύ άλλων λειτουργιών ( 97 – 100 ). Στη συνέχεια, δείχνουμε ότι τα ενεργοποιημένα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα CD4 + και CD8 + (PD-1 + και CD38 + /HLA-DR + ) επεκτείνονται σημαντικά στη μυοπερικαρδίτιδα νωρίς μετά τον εμβολιασμό, εκφράζοντας περαιτέρω τους υποδοχείς χημειοκίνης CXCR3 και CCR5, των οποίων οι συνδέτες, CXCL10 και CCL4, αντίστοιχα, αυξήθηκαν ταυτόχρονα στους ορούς των ασθενών. Ως ρυθμιστές κυτταροτοξικών Τ κυττάρων και ΤΗ1 από τις αποκρίσεις, αυτές οι χημειοκίνες παίζουν κεντρικούς ρόλους στη διήθηση των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων του καρδιακού ιστού, όπως αποδείχθηκε προηγουμένως σε φλεγμονώδεις καρδιαγγειακές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της κλασικής μυοκαρδίτιδας ( 50-58 ). Χρησιμοποιώντας ανάλυση ρεπερτορίου TCR, αποκαλύψαμε ότι αυτά τα κύτταρα δεν έδειξαν ενδείξεις μονοκλωνικής επέκτασης, υποδηλώνοντας μια ανεξάρτητη από αντιγόνο, εξαρτώμενη από κυτοκίνη ενεργοποίηση μετά τον εμβολιασμό. Η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων σημειώθηκε σε μια δημοσιευμένη αναφορά από έναν ασθενή που παρουσιάστηκε μετά την πρώτη δόση εμβολιασμού mRNA-1273, η οποία επικεντρώθηκε γύρω από τις αποκρίσεις IL-18 ( 32), υποδηλώνοντας ότι μια τέτοια παθολογία πιθανότατα επικαλύπτει διαφορετικές κλινικές εκδηλώσεις και δόσεις. Περαιτέρω, αν και οι δημοσιευμένες μηχανιστικές μελέτες για τη μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο SARS-CoV-2 παραμένουν σπάνιες, οι αναφορές από βιοψίες καρδιάς υποστηρίζουν τα αποτελέσματά μας, καταδεικνύοντας λεμφοκυτταρική διήθηση (34 – 36, 80 ) , συμπεριλαμβανομένων των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων HLA-DR + ( 30 ) . Αυτά τα ευρήματα διαφέρουν από προηγουμένως αναφερθείσες μορφές μυοκαρδίτιδας σχετιζόμενης με εμβόλια (συμπεριλαμβανομένου του εμβόλια μετά από ανατοξίνη τετάνου, συζευγμένου μηνιγγιτιδοκοκκικού C και ηπατίτιδας Β και ευλογιάς), όπου οι παθολογίες ήταν σε μεγάλο βαθμό ηωσινοφιλικές (101-103 ) .
Η διαχρονική κλινική παρακολούθηση μήνες μετά τον εμβολιασμό αποκάλυψε επίμονες ανωμαλίες της καρδιακής απεικόνισης σε ορισμένους ασθενείς, κυρίως LGE στην απεικόνιση CMR, υποδηλώνοντας καρδιακή ίνωση ( 104-106 ) . Επιπρόσθετα, παρατηρήσαμε αυξήσεις σε διάφορα ένζυμα αναδιαμόρφωσης εξωκυτταρικής μήτρας ορού (MMP1, MMP8, MMP9 και TIMP1), αυξημένα φλεγμονώδη κλασικά μονοκύτταρα (CCR2 + CD163 + ) που φέρουν πλεονασματική υπογραφή και αύξηση στο sCD163, ενδεικτικό καρδιακής μακροφάνειας ενεργοποίησης. Τα κλινικά, κυτταρικά και μοριακά ευρήματά μας δυνητικά υποδεικνύουν συνεχιζόμενη επούλωση τραυμάτων, αναδιαμόρφωση ιστού και σχηματισμό ουλής μετά από καρδιακό τραυματισμό σε αυτούς τους ασθενείς ( 39 , 107-111). Τα απελευθερωμένα σήματα σχετιζόμενα με βλάβη, εκτός από την αύξηση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β, όπως φαίνεται στους ορούς των ασθενών, που προκαλούνται από καρδιακή βλάβη, μπορούν να προκαλέσουν στρατολόγηση μονοκυττάρων/μακροφάγων, επιδεινώνοντας περαιτέρω τη φλεγμονή στη μυοκαρδίτιδα και/ή καταλήγοντας σε ίνωση των ιστών ( 39 , 74 , 76 ). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζονται από δημοσιευμένες αναφορές βιοψίας καρδιάς που δείχνουν διήθηση μακροφάγου στον καρδιακό ιστό ( 34 – 36 ). Πιο πρόσφατα, μια μεγάλη κλινική μελέτη 69 συνολικά ασθενών με κλινικά ύποπτη μυοκαρδίτιδα σχετιζόμενη με το εμβόλιο SARS-CoV-2 ανέφερε 40 επιβεβαιωμένες με βιοψία περιπτώσεις με προεξέχοντα Τ κύτταρα και διήθηση μακροφάγου καρδιακού ιστού ( 80). Σε μια αναφορά, επικαλυπτόμενη ανοσοδιήθηση Τ-λεμφοκυττάρων και μακροφάγων βρέθηκε επιπλέον στη θέση ένεσης του εμβολίου στον δελτοειδή μυ ( 112 ). Μια άλλη ιστοπαθολογική μελέτη 15 κλινικά ύποπτων περιπτώσεων ανέφερε περαιτέρω καρδιακή διήθηση των HLA-DR + T κυττάρων και των μακροφάγων MAC-1 + ( 30 ), τα οποία είναι σύμφωνα με τα ανώμαλα υποσύνολα ανοσοκυττάρων που ορίζουμε εδώ. Έτσι, τα μοριακά και κυτταρικά ανοσολογικά ευρήματά μας εδώ υποστηρίζονται από δημοσιευμένα ιστολογικά στοιχεία, παρουσιάζοντας τον πρώτο χαρακτηρισμό αυτών των πιο πιθανών παθογόνων υποπληθυσμών φλεγμονωδών κυττάρων.
Το ερώτημα γιατί τέτοιες ανεπιθύμητες ενέργειες αναπτύσσονται πιο συχνά μετά τη δεύτερη δόση είναι ενδιαφέρον. Πρόσφατες προσεγγίσεις εμβολιολογίας συστήματος αποκάλυψαν ότι το εμβόλιο mRNA BNT162b2 διέγειρε μόνο μέτριες εγγενείς ανοσολογικές αποκρίσεις μετά την πρώτη δόση. Αυτές οι αποκρίσεις ενισχύθηκαν ουσιαστικά μετά από δευτερογενή ανοσοποίηση ( 59 ). Οι συγγραφείς ανέφεραν περαιτέρω σημαντική αύξηση της IFN-γ και της CXCL10 στο πλάσμα (επίσης γνωστή ως IFN-γ-επαγόμενη πρωτεΐνη 10) λίγο μετά τη δευτερογενή ανοσοποίηση, προτείνοντας ένα μοντέλο «ανάδρασης κυτοκίνης» που ρυθμίζει τις εγγενείς ανοσολογικές αποκρίσεις. Επιπλέον, έχουν επίσης περιγραφεί αποτελεσματικές αποκρίσεις εμβολίου mRNA ότι επάγουν συστηματική IL-15 ( 113), και άλλες κυτοκίνες μπορεί να δρουν τοπικά στον ιστό (δηλαδή, μη μετρήσιμα αυξημένες στη συστηματική κυκλοφορία) για να οδηγήσουν δυνητικά τις κυτταροτοξικές λεμφοκυτταρικές αποκρίσεις στη μυοπερικαρδίτιδα. Η IFN-γ συσχετίστηκε περαιτέρω με τα επίπεδα pSTAT3, τα οποία κορυφώθηκαν 1 ημέρα μετά τον δευτερογενή εμβολιασμό σε HDs σε διάφορους τύπους κυττάρων ( 59 ). Σε ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα εδώ, τα επίπεδα pSTAT3 στα CD8 + Τ κύτταρα ήταν αυξημένα αρκετές ημέρες μετά τον εμβολιασμό κατά τη διάρκεια της νοσηλείας, σύμφωνα με παρατεταμένη κυτταροκινοπάθεια μετά τον εμβολιασμό. Η IFN-γ είναι γνωστό ότι ενισχύει την έκφραση HLA-DR στα Τ κύτταρα κατά την ενεργοποίηση, όπως παρατηρείται στους ασθενείς μας, η οποία φαίνεται περαιτέρω στη διήθηση της καρδιάς CTL στη μυοκαρδίτιδα ( 114). Επιπλέον, ο CXCR3, ο ενεργοποιημένος υποδοχέας υποδοχής κυττάρων Τ για CXCL10 που προκαλείται από IFN-γ, έχει χαρακτηριστεί ότι διευκολύνει τη διαφοροποίηση των CD8 + Τ κυττάρων σε βραχύβια τελεστικά κύτταρα, αντί για μακρόβια μνήμη, με τη μεσολάβηση της κυτταρικής μετανάστευσης. στη δύναμη του φλεγμονώδους ερεθίσματος ( 115 – 117), το οποίο μπορεί να υποδηλώνει μειωμένες αποκρίσεις μακροπρόθεσμης μνήμης Τ κυττάρων στον εμβολιασμό σε τέτοιους ασθενείς, με σημαντικές επιπτώσεις για την αποτελεσματική ανάπτυξη εμβολίου. Αυτά τα συσσωρευμένα αποδεικτικά στοιχεία συμπληρώνουν τις παρατηρήσεις μας, σύμφωνα με τις οποίες τα ευαίσθητα άτομα μπορεί να εμφανίσουν αυξημένη ανοσοαπόκριση που καθοδηγείται από κυτοκίνη στον εμβολιασμό και, ιδιαίτερα, λίγο μετά τη δεύτερη δόση, ενεργοποιώντας κατά συνέπεια ανοσοενεργούς και προκαλώντας καρδιακή φλεγμονή. Το αν τέτοιες αποκρίσεις διέπονται από αποκρίσεις εικονικής μνήμης ( 118 ) ή από επιγενετικό επαναπρογραμματισμό υποσυνόλων τελεστών και/ή έμφυτη ανοσολογική μνήμη ( 119-122 ) είναι ένα θεμελιώδες ερώτημα που δικαιολογεί μελλοντική διερεύνηση.
Αν και το συστατικό LNP του εμβολίου μόνο βρέθηκε να είναι εξαιρετικά φλεγμονώδες, τέτοιες αποκρίσεις επικεντρώθηκαν στην IL-6 και την IL-1β ( 41 , 123 ). Η IL-1β ήταν αυξημένη στην ομάδα των ασθενών μας και μαζί με την ανάντη ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 και τις σχετικές κυτοκίνες μπορεί να παίξουν ρόλο στην παθογένεση της μυοκαρδίτιδας ( 32 , 39 ). Ωστόσο, η επαγωγή της IL-1β από εμβόλια RNA που έχουν διαμορφωθεί με λιπίδια, τα οποία στη συνέχεια μπορούν να διεγείρουν διάφορες προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, φάνηκε επίσης ότι εξαρτάται τόσο από τη σύνθεση RNA όσο και από τη λιπιδική σύνθεση σε ανθρώπινα ανοσοκύτταρα ( 124). Έτσι, ένας σύνθετος ρόλος της πλατφόρμας χορήγησης ανοσοενισχυτικού σε συνέργεια με αντιγόνα που φέρουν εμβόλια είναι πιο πιθανό ο οδηγός μιας υπερβολικής ανοσοαπόκρισης κυτοκίνης που οδηγεί σε καρδιακή παθολογία μετά τον εμβολιασμό σε ευαίσθητα άτομα. Το τι προκαλεί ορισμένα άτομα, κυρίως έφηβους και νεαρούς ενήλικες άνδρες, να είναι πιο επιρρεπή σε αυτές τις ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με την καρδιά δεν είναι ξεκάθαρο αλλά πιθανότατα δεν είναι μοναδικό στην παθογένεση που προκαλείται από το εμβόλιο. Μια προκατάληψη προς τους νεότερους άνδρες παρατηρείται ομοίως στην επίκτητη από την κοινότητα μυοκαρδίτιδα/περικαρδίτιδα, όπου πολλές επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες μεγάλης κλίμακας έχουν δείξει ότι οι ασθενείς είναι πολύ πιο συχνά άνδρες (65 έως 84% των ασθενών) και σημαντικά νεότεροι από γυναίκες ασθενείς ( 125 – 136), υποδηλώνοντας δυνητικά αυξημένες ανοσολογικές και/ή φλεγμονώδεις αποκρίσεις σε αυτές τις δημογραφικές ομάδες.
Η μελέτη μας έχει κάποιους περιορισμούς. Αν και η κοόρτη της μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο LNP-mRNA είναι μία από τις μεγαλύτερες που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, και η υπόθεσή μας είναι σύμφωνη με δημοσιευμένες αναφορές από άλλους ασθενείς, ο αριθμός των συμμετεχόντων παραμένει περιορισμένος για την εξαγωγή γενικών συμπερασμάτων. Επιπλέον, παρά τη χρήση πολλών ομάδων ελέγχου για να διασφαλίσουμε ότι τα ευρήματά μας είναι μοναδικά για τη μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο, οι διακυμάνσεις της ηλικίας, της δόσης του εμβολίου ή του χρόνου μετά τον εμβολιασμό μεταξύ των ατόμων αποτελούν σκέψεις για ερμηνεία και γενικά συμπεράσματα. Η υψηλής απόδοσης ανάλυση αυτοαντισωμάτων μας από το REAP επικεντρώθηκε επίσης σε εξωκυτταρικά/εκκρινόμενα αντιγόνα, επομένως τα ενδοκυτταρικά αυτοαντιγόνα μπορεί να διαδραματίζουν ακόμα ρόλο στην παθογένεση, αν και αυτό δεν υποστηρίχθηκε σε προηγούμενες μελέτες ( 32). Επιπλέον, η συμβολή των γενετικών παραλλαγών που μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία στη μυοκαρδίτιδα δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί και αποτελεί ενεργό πεδίο έρευνας. Τέλος, η μελέτη μας δεν είχε δείγματα ιστού για να επιβεβαιώσει τον τελεστικό ανοσοποιητικό πληθυσμό που διεισδύει στην καρδιά, ωστόσο τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με τις προηγούμενες δημοσιευμένες αναφορές βιοψίας.
Με βάση τα ευρήματά μας, η διαχρονική κλινική παρακολούθηση ασθενών με μυοπερικαρδίτιδα που σχετίζεται με το εμβόλιο μπορεί να δικαιολογείται για την αξιολόγηση της πιθανής εμμονής των καρδιακών ανωμαλιών. Είναι επίσης σημαντικό να ληφθεί υπόψη ο σπάνιος κίνδυνος ανεπιθύμητων ενεργειών και πιθανών κλινικών επιπτώσεων μετά τον εμβολιασμό SARS-CoV-2 ( 2 , 5 ) σε σύγκριση με τους μεγαλύτερους κινδύνους επακόλουθων (συμπεριλαμβανομένης της μυοκαρδίτιδας), νοσηλείας ή/και θανάτου που προκύπτουν από μόλυνση με SARS-CoV-2 ( 5 , 24 , 137-140). Η μελέτη μας αξιοποιεί μια σπάνια ομάδα ασθενών και παρουσιάζει ευρήματα με πιθανές επιπτώσεις για την ανάπτυξη εμβολίων και την κλινική φροντίδα. Μελλοντικές μελέτες που βασίζονται στη μεταφραστική συνάφεια της εργασίας μας θα είναι σημαντικές για την περαιτέρω βελτιστοποίηση του άριστο προφίλ ασφάλειας των εμβολίων mRNA μεταξύ συγκεκριμένων δημογραφικών υποομάδων. Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας πιθανότατα αποκλείουν ορισμένους προηγουμένως προτεινόμενους μηχανισμούς μυοπερικαρδίτιδας που σχετίζεται με το εμβόλιο mRNA και εμπλέκουν ανώμαλη ενεργοποίηση και κυτταροτοξικότητα λεμφοκυττάρων που προκαλείται από κυτοκίνη, καθώς και φλεγμονώδεις και προϊβρωτικές αποκρίσεις μυελοειδών στην ανοσοπαθολογία που εμφανίζεται σε ευαίσθητους ασθενείς μετά από εμβολιασμό mRNA.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Σχεδιασμός μελέτης
Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση του συστημικού ανοσοπαθολογικού τοπίου που υποκρύπτει σπάνιες περιπτώσεις μυοπερικαρδίτιδας που εμφανίζονται μετά τον εμβολιασμό κατά SARS-CoV-2 LNP-mRNA. Μια συνολική κοόρτη 23 ασθενών που ανέπτυξαν μυοκαρδίτιδα και/ή περικαρδίτιδα με αυξημένα επίπεδα τροπονίνης, BNP και CRP καθώς και καρδιακές ανωμαλίες απεικόνισης λίγο μετά τον εμβολιασμό συγκρίθηκε με υγιή VCs, μεταξύ άλλων ομάδων. Διαφορετικά υποσύνολα αυτών των ασθενών σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας πολυτροπικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων αντισωμάτων SARS-CoV-2 και εξουδετέρωσης, υψηλής απόδοσης προφίλ καρδιακών αυτοαντισωμάτων εξωπρωτεοειδών, πρωτεϊνομετρία ορού, κυτταρομετρία ροής, ELISA και μεταγραφή μονοκυττάρου περιφερικού αίματος και προσδιορισμό αλληλουχίας ρεπερτορίου για την ανοσολογική αλληλουχία αλλοιώσεις. Τελευταίος,
Έρευνα ανθρώπινων συμμετεχόντων
Οι άνθρωποι που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων τους για έρευνα και τη δημοσίευση αποπροσδιορισμένων δεδομένων σύμφωνα με τις αρχές του Ελσίνκι για εγγραφή σε ερευνητικά πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικής Αναθεώρησης (IRB) του Πανεπιστημίου Yale (πρωτόκολλα 2000028924 και 1605017838 ). Για ένα υποσύνολο ασθενών, των οποίων η συμπερίληψη έγινε αποκλειστικά για ανασκόπηση ιατρικού φακέλου για την παρακολούθηση του πληθυσμού και τις έρευνες εμβολίων, το IRB ενέκρινε τη μελέτη και παραιτήθηκε από την απαίτηση για ενημερωμένη συναίνεση (πρωτόκολλο 2000028093). Όλοι οι σχετικοί κανόνες δεοντολογίας για την εργασία με ανθρώπους συμμετέχοντες τηρήθηκαν.
Επεξεργασία δειγμάτων αίματος
Για τις δοκιμές αντισώματος, εξουδετέρωσης, REAP και κυτοκίνης, συλλέχθηκε πλήρες αίμα σε ηπαρινισμένα κενά αίματος CPT (BDAM362780, BD) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία την ίδια ημέρα συλλογής. Δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση πλήρους αίματος στα 600 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το μη αραιωμένο πλάσμα μεταφέρθηκε σε σωλήνες πολυπροπυλενίου 1,8 ml Eppendorf και αποθηκεύτηκε στους -80°C για επακόλουθη ανάλυση. Για τις κλινικές παραμέτρους του αίματος, η σημασία προσδιορίστηκε μέσω σύγκρισης με φυσιολογικά εύρη αναφοράς που χρησιμοποιούνται στο Νοσοκομείο Yale New Haven για κάθε δοκιμή.
Για την ανάλυση scRNA-seq, τα PBMCs απομονώθηκαν πρώτα με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) ή Lymphoprep (STEMCELL Technologies). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI 1640 (cRPMI) (Lonza) που περιείχε 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 2 mM γλουταμίνη και πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (100 U/ml το καθένα Invitrogen). Στη συνέχεια, τα PBMC αποθηκεύτηκαν στους 106κύτταρα ανά ml σε διμεθυλοσουλφοξείδιο 10% σε FBS και αποθηκεύονται στους -80°C όλη τη νύχτα πριν από την περαιτέρω αποθήκευση σε υγρό άζωτο. Ο ορός απομονώθηκε με φυγοκέντρηση των σωλήνων ορού και αποθήκευση του υπερκειμένου σε δείγματα, τα οποία καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο πριν από την κρυοσυντήρηση στους -80°C. Όλα τα PBMC ασθενών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και κρυοσυντηρήθηκαν εντός 1 έως 6 ωρών από την αιμοληψία. Όλα τα HD PBMC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εντός 24 ωρών για να ληφθεί υπόψη η αποστολή ολονύκτιας.
Ειδικά αντισώματα SARS-CoV-2
Η ELISA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 141). Εν ολίγοις, το Triton X-100 και η ριβονουκλεάση Α προστέθηκαν σε δείγματα ορού σε τελικές συγκεντρώσεις 0,5% και 0,5 mg/ml, αντίστοιχα, και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά πριν από τη χρήση για να μειωθεί ο κίνδυνος από οποιονδήποτε πιθανό ιό στον ορό. Οι πλάκες MaxiSorp (96 φρεάτια, 442404, Thermo Fisher Scientific) επικαλύφθηκαν με ανασυνδυασμένο SARS-CoV-2 S total (50 μl ανά φρεάτιο, 100 μg; SPN-C52H9, ACROBiosystems), S1 (100 μg, S1N-C52S) και RBD (100 μg, SPD-C52H3, ACROBiosystems) σε συγκέντρωση 2 μg/ml σε PBS και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C. Το ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης αφαιρέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με 200 μl διαλύματος αποκλεισμού [PBS με 0,1% Tween 20 (PBS-T) και 3% σκόνη γάλακτος]. Το πλάσμα αραιώθηκε σειριακά σε 1:100, 1:200, 1:400 και 1:800 σε διάλυμα αραίωσης (PBS-T και 1% σκόνη γάλακτος), και 100 μl αραιωμένου ορού προστέθηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ανθρώπινο anti-spike (SARS-CoV-2 human anti-spike κλώνος AM006415; 91351, Active Motif) και αντι-νουκλεοκαψίδιο (SARS-CoV-2 ανθρώπινος αντι-νουκλεοκαψιδικός κλώνος 1A6; MA5-35941, Invitrogen) δημιουργήθηκαν σειριακά μια τυπική καμπύλη. Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-T και 50 μl αντισώματος αντι-ανθρώπινου IgG υπεροξειδάσης χρένου (1:5000; A00166, GenScript) αραιωμένο σε διάλυμα αραίωσης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 1 ώρα επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, οι πλάκες πλύθηκαν έξι φορές με PBS-T. Οι πλάκες αναπτύχθηκαν με 100 μl σετ αντιδραστηρίων υποστρώματος 3,3′,5,5′-τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) (555214, BD Biosciences) και η αντίδραση σταμάτησε μετά από 5 λεπτά με την προσθήκη θειικού οξέος 2 Ν. Στη συνέχεια οι πλάκες διαβάστηκαν σε μήκη κύματος 450 nm και 570 nm.
Κυτταρικές γραμμές και ιός
Επιθηλιακά κύτταρα νεφρού Vero Ε6 (C1008, CRL-1586) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle’s Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 1% πυροσταφυλικό νάτριο, μη απαραίτητα αμινοξέα και 5% FBS στους 37°C και 5% CO2 . Η κυτταρική σειρά ελήφθη από την American Type Culture Collection και ήταν αρνητική για μόλυνση με Mycoplasma χρησιμοποιώντας κιτ που διατίθενται στο εμπόριο. Το SARS-CoV-2 (προγονικό στέλεχος, D614G) USA-WA1/2020 ελήφθη από την BEI Resources (NR-52281) και ενισχύθηκε ελάχιστα σε κύτταρα Vero E6 για τη δημιουργία λειτουργικών αποθεμάτων ιού. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε εγκαταστάσεις Βιοασφάλειας Επιπέδου 3 με έγκριση από το γραφείο Περιβαλλοντικής Υγείας και Ασφάλειας του Yale.
Δοκιμασία εξουδετέρωσης
Ο ασθενής και ο ορός VC απομονώθηκαν όπως παραπάνω και υποβλήθηκαν σε θερμική επεξεργασία για 30 λεπτά στους 56°C. Το πλάσμα αραιώθηκε σειριακά από 1:10 έως 1:2430 και επωάστηκε με SARS-CoV-2 (προγονικό στέλεχος, D614G) για 1 ώρα στους 37°C. Το εμβόλιο στη συνέχεια επωάστηκε με κύτταρα Vero Ε6 σε πλάκα έξι φρεατίων για 1 ώρα για προσρόφηση. Στη συνέχεια, τα μολυσμένα κύτταρα επικαλύφθηκαν με DMEM συμπληρωμένο με NaHC03 , 2% FBS και 0,6% μίγμα Avicel. Οι πλάκες διαχωρίστηκαν 40 ώρες μετά τη μόλυνση με στερέωση σε 4% φορμαλδεΰδη για 1 ώρα ακολουθούμενη από χρώση σε 0,5% κρυσταλλικό ιώδες. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν παράλληλα με ορούς αρνητικού ελέγχου με καθιερωμένη ιική συγκέντρωση επαρκή για τη δημιουργία 60 έως 120 πλακών σε φρεάτια ελέγχου.
ΘΕΡΙΖΩ
Ο καθαρισμός αντισωμάτων, η προσρόφηση ζυμομύκητα και οι επιλογές βιβλιοθήκης, η προετοιμασία της βιβλιοθήκης NGS και ο υπολογισμός της βαθμολογίας REAP πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 43 , 44 , 86 ). Ένα πιο λεπτομερές πρωτόκολλο περιλαμβάνεται επίσης στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.
Ανάλυση κυτοκίνης
Το πλάσμα απομονώθηκε από ασθενείς όπως περιγράφηκε παραπάνω. Τα επίπεδα των κυτοκινών αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμους προμηθευτές, που περιγράφηκαν εκτενώς προηγουμένως ( 142 ). Εν συντομία, οι οροί απεστάλησαν στην Eve Technologies (Κάλγκαρι, Αλμπέρτα, Καναδάς) σε ξηρό πάγο και τα επίπεδα κυτοκινών και χημειοκινών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το Human Cytokine Array/Chemokine Array 71-403 Plex Panel (HD71) και το Human Matrix Panel (Metalloprotease). HDMYO-3-12). Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν κατά την πρώτη απόψυξη. Τα δείγματα κάτω από το εύρος ανίχνευσης αντικαταστάθηκαν με τη χαμηλότερη παρατηρούμενη τιμή για ποσοτικοποίηση.
Η PCA και η ιεραρχική ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το MATLAB 2020b (MathWorks Inc.) χρησιμοποιώντας τυπικές ενσωματωμένες συναρτήσεις. Ο εμπλουτισμός γονιδίου πραγματοποιήθηκε σε αναγνωρισμένες συστάδες χρησιμοποιώντας ανάλυση GO για τον προσδιορισμό της σημασίας και αναφέρθηκαν οι 10 κορυφαίες ιεραρχικές, βιολογικές διεργασίες ( 143 , 144 ).
ELISA
Ο ορός απομονώθηκε όπως παραπάνω μαζί με την απομόνωση PBMC, καταψύχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80°C μέχρι περαιτέρω χρήση. Ο ορός στη συνέχεια αποψύχθηκε στους 37°C και επιστρώθηκε εις διπλούν ή εις τριπλούν. Τα πρότυπα έγιναν φρέσκα για κάθε δοκιμασία. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα κιτ ELISA MAX Deluxe Set Human IL-15 (BioLegend, αρ. καταλόγου 435104) και τα κιτ CD163 Human ELISA (Thermo Fisher Scientific, αρ. καταλόγου EHCD163) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.
scRNA-seq και ευθυγράμμιση
Τα κρυοσυντηρημένα PBMC αποψύχθηκαν σε λουτρό νερού στους 37°C για ~2 λεπτά και απομακρύνθηκαν από το λουτρό νερού όταν παρέμεινε ένας μικροσκοπικός κρύσταλλος πάγου. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε κωνικό σωλήνα 15 ml προθερμασμένου μέσου ανάπτυξης. Το κρυοφιαλίδιο ξεπλύθηκε με πρόσθετο μέσο ανάπτυξης (10% FBS σε DMEM) για να ανακτηθούν τα υπόλοιπα κύτταρα και το μέσο έκπλυσης προστέθηκε στον κωνικό σωλήνα των 15 ml ενώ ανακινούσε απαλά το σωληνάριο.
Τα αποψυγμένα PBMC φυγοκεντρήθηκαν στα 400 g για 8 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και το υπερκείμενο αφαιρέθηκε χωρίς να διαταραχθεί το κυτταρικό ίζημα. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 × PBS με 2% FBS και τα κύτταρα διηθήθηκαν με φίλτρο κυττάρων 30 μΜ. Η κυτταρική συγκέντρωση προσαρμόστηκε στα 1000 κύτταρα ανά μl με βάση τον αριθμό των κυττάρων και τα κύτταρα φορτώθηκαν αμέσως στο 10x Chromium Next GEM Chip G σύμφωνα με τον οδηγό χρήσης του κατασκευαστή [Chromium Next GEM SingleCell V(D)J Reagent Kits v1 .1]. Στόχος μας ήταν να επιτύχουμε μια απόδοση ~ 10.000 κυττάρων ανά λωρίδα.
Δημιουργήθηκαν βιβλιοθήκες cDNA για έκφραση γονιδίου και προσδιορισμό αλληλουχίας TCR/BCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Chromium Next GEM SingleCell V(D)J Reagent Kits v1.1). Στη συνέχεια, η αλληλουχία κάθε βιβλιοθήκης έγινε σε μια πλατφόρμα Illumina NovaSeq 6000. Τα δεδομένα αλληλουχίας μεταγραφώματος ενός κυττάρου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας CellRanger v5.0.1 και ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς GRCh38 ( 145 ). Οι αναγνώσεις επιφανειακής πρωτεΐνης CITE-seq ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παρεχόμενο λεξικό αντισωμάτων με ετικέτα.
Ποιοτικός έλεγχος, προεπεξεργασία και ενσωμάτωση
Μετά την ευθυγράμμιση και την ποσοτικοποίηση των δεδομένων, πραγματοποιήσαμε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου πριν προχωρήσουμε στην επεξεργασία των δεδομένων και την ανάλυση κατάντη. Πρώτον, αφαιρέθηκαν γονίδια που εκφράζονται σε λιγότερα από πέντε κύτταρα και κύτταρα με λιγότερα από 200 γονίδια ή περισσότερο από 10% μιτοχονδριακό γονιδιακό κλάσμα.
Τα φιλτραρισμένα δεδομένα ενός κυττάρου στη συνέχεια ενσωματώθηκαν και τα αποτελέσματα παρτίδας διορθώθηκαν χρησιμοποιώντας συμπέρασμα μεταβολής ενός κυττάρου (scVI) ( 146 ) με ένα παραγωγικό μοντέλο 64 λανθάνουσας μεταβλητής και 500 επαναλήψεων. Πιο συγκεκριμένα, το αρνητικό διωνυμικό μοντέλο του scVI χρησιμοποιήθηκε σε ακατέργαστες μετρήσεις, επιλέγοντας 5000 εξαιρετικά μεταβλητά γονίδια που προσδιορίστηκαν με την εγγενή μέθοδο του εργαλείου στα συνδυασμένα σύνολα δεδομένων για την παραγωγή λανθάνουσας μεταβλητής. Για να ελαχιστοποιηθεί η εξάρτηση της ομαδοποίησης από τα αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου, προηγουμένως καθορισμένα γονίδια ειδικά για τη φάση του κυτταρικού κύκλου στο πακέτο Seurat ( 147) εξαιρέθηκαν από αυτόν τον κατάλογο γονιδίων υψηλής μεταβλητότητας. Τα δεδομένα από ασθενείς με οξεία μυοπερικαρδίτιδα, E-YVCs, ασθενείς που έχουν αναρρώσει και HDs ενσωματώθηκαν για ανάλυση κατάντη. Τέσσερα δείγματα MIS-C CITE-seq συμπεριλήφθηκαν επίσης για να βοηθήσουν στον σχολιασμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας δείκτες επιφανειακής πρωτεΐνης.
Η λανθάνουσα αναπαράσταση που δημιουργήθηκε από το scVI χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του γραφήματος γειτονιάς ( scanpy.pp.neighbors ), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ομαδοποίηση Louvain ( scanpy.tl.louvain ) και την οπτικοποίηση Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) ( scanpy.tl.umap ).
Πριν από τη ομαδοποίηση, για να βοηθηθεί ο σχολιασμός κελιών, το Single-Cell Remover of Doublets (Scrublet) ( 148 ) χρησιμοποιήθηκε για την προκαταρκτική επισήμανση διπλών με τον υπολογισμό μιας βαθμολογίας διπλών για κάθε κελί. Ειδικότερα, ένα τεστ Student’s t ( P <0,01) και διόρθωση Bonferroni χρησιμοποιήθηκαν στο πλαίσιο της λεπτομερούς υποομαδοποίησης κάθε συστάδας που αρχικά προσδιορίστηκε από τον αλγόριθμο Louvain.
Η επεξεργασία δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την εργαλειοθήκη Scanpy ( 149 ) σύμφωνα με δημοσιευμένες συνιστώμενες τυπικές πρακτικές. Πριν από την κατάντη ανάλυση, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν ( scanpy.pp.normalize_per_cell , συντελεστής κλιμάκωσης = 10 4 ) και μετασχηματίστηκαν log ( scanpy.pp.log1p ). Για θερμικούς χάρτες γονιδιακής έκφρασης, τα δεδομένα κλιμακώθηκαν περαιτέρω ( scanpy.pp.scale , μέγιστη τιμή = 10).
Αναγνώριση συμπλέγματος και σχολιασμός υποσυνόλου ανοσίας
Πρώτον, χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για τη μεταφορά προκαταρκτικών σχολιασμών κελιών από το προηγούμενο δημοσιευμένο σύνολο δεδομένων MIS-C ( 63 ) χρησιμοποιώντας γονίδια υψηλής μεταβλητότητας ( scanpy.pp.highly_variable_genes ) που μοιράζονται μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων για την καθοδήγηση της αναγνώρισης συμπλέγματος. Στη συνέχεια, η ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Louvain με αρχική ανάλυση τριών, και οι προκύπτουσες συστάδες ορίστηκαν με βάση την έκφραση δημοσιευμένων γονιδιακών δεικτών ειδικών για κύτταρο. Για διφορούμενες συστάδες, πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης σε σύγκριση με όλες τις άλλες συστάδες ( scanpy.tl.rank_genes_groups ) και τα κορυφαία γονίδια που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για τον αμερόληπτο προσδιορισμό της κυτταρικής ταυτότητας.
Οι αρχικές προβλέψεις διπλών από τον Scrublet αναθεωρήθηκαν εδώ και οι διπλές επιβεβαιώθηκαν με βάση τη συνέκφραση συστάδων ετερογενών δεικτών γονιδίων γενεαλογίας (π.χ. CD3 , CD19 και CD14 ) μαζί με τις κατανομές n_counts και n_genes. Εκτός από την αφαίρεση των διπλών, οι συστάδες που εμφάνιζαν μοτίβα νεκρών κυττάρων με υψηλή περιεκτικότητα σε μιτοχόνδρια αφαιρέθηκαν περαιτέρω. Εκλεπτυσμένες υποομάδες χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση και οπτικοποίηση δεδομένων κατάντη, συμπεριλαμβανομένης της συχνότητας τύπου κυττάρου, της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης και των αναλύσεων ρεπερτορίου.
Αναλογίες υποσυνόλου κελιών
Για να προσδιορίσουμε σημαντικές αλλαγές στις αναλογίες των προσδιοριζόμενων υποσυνόλων μεταξύ των ομάδων, λαμβάνοντας υπόψη τις εξαρτήσεις σύνθεσης μεταξύ των υποσυνόλων στα δεδομένα scRNA-seq, χρησιμοποιήσαμε το Μπεϋζιανό μοντέλο scCODA ( 49 ). Συγκεκριμένα, για κάθε υποσύνολο, η ομάδα μυοπερικαρδίτιδας συγκρίθηκε με την ομάδα E-YVC και χρησιμοποιήθηκαν προεπιλεγμένες παράμετροι. Οι αλλαγές που ταξινομήθηκαν από το scCODA ως αξιόπιστες μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις (FDR < 0,05) θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Σε ορισμένες περιπτώσεις όπου οι αλλαγές δεν ταξινομήθηκαν ως σημαντικές με τη μέθοδο scCODA, χρησιμοποιήσαμε τη μη παραμετρική, μη ζευγαρωμένη, διπλής όψης δοκιμή κατάταξης Wilcoxon με διόρθωση FDR Benjamini-Hochberg για πολλαπλές συγκρίσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως (150) και αναφέρουμε το ακριβές προσαρμοσμένο Pαξία, δεδομένου ότι τέτοιες αλλαγές μπορεί να εξακολουθούν να είναι βιολογικά σημαντικές.
Διαφορική γονιδιακή έκφραση
Η συσκευασία limma ( 151 ) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθούν διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (FDR < 0,05). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε είτε συγκρίνοντας διαφορετικά υποσύνολα κυττάρων είτε στο ίδιο υποσύνολο κυττάρων συγκρίνοντας κύτταρα από διαφορετικές ομάδες. Τα κορυφαία διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από το logFC (προκαθορισμένα και προς τα κάτω ρυθμισμένα) και δημοσιευμένα σύνολα γονιδίων μονοπατιών χρησιμοποιήθηκαν για τη γραφική παράσταση και την απεικόνιση θερμικού χάρτη μετά την κλίμακα δεδομένων.
Βαθμολογίες γονιδιακής έκφρασης
Δημοσιευμένα σύνολα γονιδίων από το MSigDB χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των μέσων βαθμολογιών εμπλουτισμού σε κελιά καθορισμένων υποσυνόλων, όπως καθορίζεται στα θρυλικά σχήματα χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση scanpy.tl.score_genes με προεπιλεγμένες παραμέτρους.
Χαρτογράφηση σχολιασμών μεταξύ συνόλων δεδομένων
Για τη χαρτογράφηση πληθυσμών ανοσίας ενός κυττάρου μεταξύ συνόλων δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το scikit-learn με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Για τα καρδιακά κύτταρα, υποσύνολα λεμφοκυττάρων Τ από δημοσιευμένα δεδομένα ενός κυττάρου ( 60 ) χρησιμοποιήθηκαν για την εκπαίδευση του μοντέλου χρησιμοποιώντας δεδομένα έκφρασης γονιδίων υψηλής μεταβλητότητας ( scanpy.pp.highly_variable_genes ) που μοιράζονται μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων. Στη συνέχεια, το μοντέλο εφαρμόστηκε για την πρόβλεψη ταιριασμένων υποσυνόλων κελιών στο σύνολο δεδομένων μας (μέση πιθανότητα πρόβλεψης = 0,9) και οπτικοποιήθηκε το ποσοστό των αντιστοιχίσεων κελιών μεταξύ των υποσυνόλων.
Ανάλυση ρεπερτορίου TCR
Η ποικιλομορφία TCR, η χρήση γονιδίων και οι αναλύσεις κλωνοτύπων έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 63 ). Ένα πιο λεπτομερές πρωτόκολλο περιλαμβάνεται επίσης στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.
Ανάλυση ρεπερτορίου BCR
Η ανάλυση του ρεπερτορίου BCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 63 ) χρησιμοποιώντας το πλαίσιο Immcantation όπως αναφέρεται παραπάνω στην ανάλυση TCR και ενσωματώθηκαν σχολιασμοί από τη συνολική ομαδοποίηση PBMC για υποσύνολα Β κυττάρων.
Κυτταρομετρία ροής
Τα PBMC ασθενούς και δότη αποψύχθηκαν όπως παραπάνω και ξεκουράστηκαν σε cRPMI για 2 ώρες στους 37°C πριν από τη χρώση. Τα κύτταρα μετρήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με e780 Fixable Viability Dye (eBioscience, αρ. καταλόγου 65-0865-14) για 15 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS με 10% FBS, με Human TruStain FcX (BioLegend, αρ. καταλόγου 422302) και True-Stain Monocyte Blocker (BioLegend, αρ. καταλόγου 426102) για 15 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κοκτέιλ επιφανειακών αντισωμάτων για 25 λεπτά σε πάγο. Για τη χρώση με φωσφο, τα κύτταρα κατεργάστηκαν πρώτα με αναστολέα Fc και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και διαπερατήθηκαν με μεθανόλη πριν από τη χρώση για ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες. Όλα τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής αποκτήθηκαν στο κυτταρόμετρο LSR Fortessa και οι στρατηγικές πύλης φαίνονται στα σχ. S9 και S10.
Στατιστική ανάλυση
Τα δεδομένα αναλύθηκαν με διάφορες στατιστικές δοκιμές όπως περιγράφεται λεπτομερώς στις αντίστοιχες επιμέρους λεζάντες των σχημάτων. Για όλες τις συγκρίσεις, οι ράβδοι σφάλματος, οι ακριβείς τιμές P και τα επίπεδα δοκιμών εμφανίστηκαν όποτε ήταν δυνατόν και έγιναν διορθώσεις για πολλαπλές συγκρίσεις όταν ήταν απαραίτητο.
Ευχαριστίες
Ευχαριστούμε τους ασθενείς και τις οικογένειές τους για τη συμμετοχή τους στην έρευνα και όλο το προσωπικό κλινικής φροντίδας για τη συνεισφορά τους. Ευχαριστούμε επίσης τους A. Zaleski, T. Murray, A. Rice, J. Wang, K. Hoehn, X. Yan, N. Li και το προσωπικό του Yale Center for Genome Analysis (YCGA) για τη συνεισφορά τους.
Χρηματοδότηση:Το CLL αναγνωρίζει χρηματοδότηση από το NIAID/NIH (R21AI144315-S1) και το Πανεπιστήμιο Yale. Το AB υποστηρίζεται από το NIGMS/NIH Medical Scientist Training Grant (T32GM136651) και την υποτροφία Paul and Daisy Soros. Το JK υποστηρίζεται από το NIGMS/NIH Medical Scientist Training Grant (T32GM136651). Το NNB αναγνωρίζει τη χρηματοδότηση από το Κέντρο Κλινικής Έρευνας του Yale και το PCCTSDP/NICHD/NIH. Η TSS αναγνωρίζει τη χρηματοδότηση από το βραβείο Race to Erase MS Young Investigator. Το IY αναγνωρίζει χρηματοδότηση από το NIAID/NIH, τα Κέντρα Ελέγχου Νοσημάτων και το Ίδρυμα Bill and Melinda Gates. Η AI αναγνωρίζει τη χρηματοδότηση από το Ιατρικό Ινστιτούτο Howard Hughes. Η CRO αναγνωρίζει χρηματοδότηση από το NIAID/NIH (K23AI159518). Η DB αναγνωρίζει τη χρηματοδότηση από το NIAID/NIH (R01HD108467).
Συνεισφορές συγγραφέων: AB, JK, AMR, SBO, AI, IY και CLL εννοιολόγησαν, σχεδίασαν και επέβλεψαν την έρευνα. Συντονισμένα κλινικά δείγματα και δεδομένα NNB, HS, VH, MC, AK, DB, CRO, JS, EKH και IY. Οι AB, JK, AR, JRJ, KMJ, TSS, MP-H., VM και CL πραγματοποίησαν πειράματα, ανέλυσαν δεδομένα και ετοίμασαν στοιχεία. Οι AB, JK, AI, IY και CLL έγραψαν το χειρόγραφο με στοιχεία και κριτική από όλους τους συγγραφείς.
Ανταγωνιστικά συμφέροντα:Η CLL ανέφερε έναν άσχετο συμβουλευτικό/συμβουλευτικό ρόλο για την Pharming Healthcare Inc. και άσχετη χρηματοδότηση προς το ίδρυμά της από την Ono Pharma. Ο IY ανέφερε ότι είναι μέλος της Ομάδας Μελέτης NIAID/COVPN mRNA-1273. έχει λάβει χρηματοδότηση στο ίδρυμά της για τη διεξαγωγή κλινικής έρευνας από την Pfizer και τη Moderna εκτός της υποβληθείσας εργασίας· και έχει άσχετο συμβουλευτικό/συμβουλευτικό ρόλο για τη Sanofi Pasteur και τη Merck. Η AI συνίδρυσε και συμβουλεύεται για τις RIGImmune, Xanadu Bio και PanV. συμβουλεύεται για την Paratus Sciences και την InvisiShield Technologies. και είναι μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου της Roche Holding Ltd. Η AMR είναι εφευρέτης ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας που περιγράφει την τεχνολογία REAP και είναι ο ιδρυτής και κατέχει μετοχές της Seranova Bio, του εμπορικού δικαιοδόχου αυτού του διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Η DB είναι ο ιδρυτής της Lab11 Therapeutics. SBO
Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών: Τα δεδομένα scRNA-seq από ασθενείς με μυοπερικαρδίτιδα και VC που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη είναι διαθέσιμα μέσω της βάσης δεδομένων Gene Expression Omnibus (GEO) με αριθμό πρόσβασης GSE230227. Προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα ενός κυττάρου ( 63) από παιδιατρικούς μάρτυρες HD και ασθενείς με MIS-C που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη μπορούν να βρεθούν στο GEO με αριθμό πρόσβασης GSE166489. Όλα τα άλλα δεδομένα που απαιτούνται για την αξιολόγηση των συμπερασμάτων στην εργασία υπάρχουν στην εργασία ή στο Συμπληρωματικό Υλικό. Τα σενάρια που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση σε αυτή τη μελέτη ακολουθούσαν τον τυπικό κώδικα όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα Υλικά και Μέθοδοι και είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Αυτό το έργο αδειοδοτείται με άδεια Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), η οποία επιτρέπει την απεριόριστη χρήση, διανομή και αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, υπό την προϋπόθεση ότι το πρωτότυπο έργο αναφέρεται σωστά. Για να δείτε ένα αντίγραφο αυτής της άδειας, επισκεφθείτε τη διεύθυνση http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Αυτή η άδεια δεν ισχύει για φιγούρες/φωτογραφίες/έργα τέχνης ή άλλο περιεχόμενο που περιλαμβάνεται στο άρθρο και πιστώνεται σε τρίτο μέρος. λάβετε εξουσιοδότηση από τον κάτοχο των δικαιωμάτων πριν χρησιμοποιήσετε αυτό το υλικό.
https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.adh3455?fbclid=IwAR3TLFx6FZpvils_-LFnsZT_rrf-L_B_-_33IEij_6IJMgM4gOfqD0S1K_s